HPLC法同时测定白花蛇舌草中4种多酚物质

李晓芬，张公信，熊华斌，马肖艳，张海芬，何耀莹，高云涛

(1.云南民族大学 化学与环境学院 云南 昆明 650500；2.云南植物药业有限公司 云南 昆明 650500)

自由基氧化损伤是现代许多重大疾病的源泉，也是引起机体衰老的根本原因[1-3].天然产物清除自由基的抗氧化剂活性研究是目前研究的热点[4-5].近年来从传统中药和民族药中筛选和测定天然抗氧化活性物质的方法备受关注[6-8].

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)为茜草科植物，主要分布在我国南方地区，味微苦、性寒、全草药用，作为一种著名的具有多种生理活性的中草药，已被广泛应用于临床治疗，包括肝炎，扁桃体炎，咽喉肿痛，胃肠炎、恶性肿瘤等疾病[9].研究表明，白花蛇舌草富含多糖、微量元素以及萜类、黄酮类多种抗氧化活性成分，具有抗癌、抗炎、增强免疫力等功效.药理学研究表明，槲皮素，山奈酚，咖啡酸，芦丁是白花蛇舌草中的主要活性成分，有文献报道这些天然活性物质具有多种药理特性，可作为抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌的物质[10-14].为了更科学合理地开发利用这种天然药物，本文建立了一种快速高效能够同时测定白花蛇舌草提取物中4种多酚物质的分析方法，为白花蛇舌草的药理活性研究提供了科学依据.

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

白花蛇舌草购于菊花村中药材市场，经筛选除杂质后粉碎过0.441 mm筛.

1.2 仪器

Agilent 1200 Series HPLC(美国安捷伦公司)；8453型UV-Vis分光光度计；AS3120A超声清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；层析柱(40 mm×10 mm)；恒温水浴锅.

1.3 试剂

DPPH(1, 1-二苯基-2-苦基肼，纯度﹥99%，Sigma公司)，标准品咖啡酸，芦丁，槲皮素和山奈酚(购自Sigma公司，纯度 >98%)；甲醇、磷酸(TED IA，色谱纯)；所用试剂均为分析纯.

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

参考文献[15]，准确称取咖啡酸2.0 mg、芦丁4.0 mg、槲皮素1.0 mg和山奈酚5.0 mg，置于10.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成咖啡酸(0.3 mg/mL)，芦丁(0.4 mg/mL)，槲皮素(0.1 mg/mL)和山奈酚(0.5 mg/mL)对照品溶液.4 ℃保存备用，使用时稀释到所需浓度即可.

2.2 供试品溶液的制备

参考文献[16]，准确称取3.0 g白花蛇舌草样品，加入甲醇溶液25 mL，室温下超声浸提30 min后抽滤，用甲醇洗涤滤渣，滤渣再重复提取3次后合并滤液，滤液蒸发浓缩后定容于容量瓶中.使用时超声除气泡，用0.45 μm微孔滤膜过滤除渣后，即得供试品溶液.

2.3 HPLC法白花蛇舌草甲醇提物主要成分分析

色谱条件为色谱柱：Agilent XDB-C18(75 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱温：35 ℃；流动相 A：甲醇；流动相 B：磷酸/水(0.5 %，V/V)；梯度洗脱程序：0～3 min (65% A)；3～10 min (50% A),10～12 min (65% A).流速：0.3 mL /min；进样量：2 μL；紫外检测器检测波长：360 nm；分析时间为10 min.

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 最佳检测波长的选择

用二极管阵列检测器(DAD)对槲皮素，山奈酚，咖啡酸，芦丁对照品甲醇溶液的紫外-可见光(200～400 nm) 进行全波长扫描发现，4种多酚物质的吸收峰集中在360 nm附近，故选择360 nm作为其检测波长.

3.1.2 流动相的选择

在很多酸性物质存在的条件下，pH值对保留时间的影响很大.文中选择了醋酸、磷酸等作为流动相，由于4种多酚物质的极性相差较大，采用了不同的洗脱方式(等度洗脱及各种梯度洗脱)和不同流动相体系(包括甲醇-水-醋酸溶液、甲醇-水-磷酸溶液V/V) 对色谱条件进行优化.实验结果表明，流动相甲醇-水-磷酸(V/V)之比对峰形和保留时间有明显影响.当采用等度洗脱时，1、2号峰在短时间内很难较好地分离，故采用梯度洗脱方式.不加磷酸时，色谱峰出现不同程度的拖尾；加入磷酸后，随着浓度的增加，色谱峰的对称性增加.考虑到色谱柱的耐酸范围，选0.5%磷酸溶液作为B相洗脱液.选择不同成分和比例的流动相进行试验，结果表明，甲醇(A)-0.5%磷酸(B)作为流动相时，4种多酚物质具有最佳分离效果.采用梯度洗脱分离方法及洗脱程序为：0～3 min (65% A),3～10 min (50% A),10～12 min (65% A).流速0.3 mL/min，在此条件下，测得的色谱图见图2(A)和图2(B).可见，4种多酚物质均得到较好的分离.

3.1.3 流速对分离度的影响

在一定流速范围内，随着流速的减少，柱效会提高，分离度变大.但若流速过慢，分析时间延长，纵向扩散的影响变大，会导致柱效降低.虽然提高流速可缩短分析时间，但如果流速过高，物质来不及分离就被洗出，分离效果差，而且还会损坏泵头和色谱柱.因此，流速对分离度的影响也很大.最终确定流速为0.3 mL/min时，出峰时间和分离效果均较满意.

3.1.4 柱温的选择

在其他色谱条件不变的条件下，分别选择柱温为20、25、30、35、40 ℃进行测定，结果发现柱温对样品的分离效果有很大的影响.当柱温太低时有些化合物几乎不能分离开，当柱温太高时样品中的一些化合物会被分解，随着化合物碎片流出的速度增加会使分离度下降.为了得到较好的分离效果和重现性较好的色谱图应该选择一个合适的温度范围.试验结果表明，当柱温为35 ℃时4种多酚物质的分离效果最佳，故选择柱温为35 ℃进行测定.

3.2 白花蛇舌草甲醇提取物的定性分析

在最佳色谱条件下测定槲皮素、山奈酚、咖啡酸，芦丁4种标准品溶液的色谱图如图2(A)所示，白花蛇舌草甲醇提取物的标准色谱图如图2(B)所示.实验结果表明4种多酚物质能够成功的彼此分离.所有的化合物在一定的浓度范围内具有较好的线性关系(R2>0.999).

3.3 方法验证

3.3.1 线性关系

精密吸取对照品混合溶液0.1、0.16、0.25、0.5、1.0 mL至5个10.0 mL容量品中用甲醇稀释至刻度.取上述对照品混合溶液20 μL进样并进行准确分析，测定其峰面积，采用外标法以峰面积A对质量浓度C进行线性回归.槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁的线性回归方程、相关系数、线性范围和保留时间如表1所示：4种多酚物质在一定的浓度范围具有较好的线性关系(R2>0.999).对照品溶液的色谱图如图2(A)所示，槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁的保留时间分别为6.400、8.121、2.592、3.424 min.

表1 4种多酚物质的线性回归方程、相关系数、线性范围和保留时间

3.3.2 精密度实验

精密吸取供试品溶液20.0 μL，重复进样5次，进行测定，槲皮素，山奈酚、咖啡酸和芦丁峰面积积分值的RSD分别为1.4%、1.6%、1.5%、1.8%，此结果表明具有良好的精密度.

表2 精密度测定结果

3.3.3 重复性试验

精密称量相同质量的白花蛇舌草样品共5份，按“2.2”操作制备供试品溶液后，在以上色谱条件下进行测定.槲皮素，山奈酚、咖啡酸和芦丁含量的RSD分别为2.37%，2.16%，2.07%，2.23%，以上数据表明分析方法具有良好的重现性.

3.3.4 稳定性实验

在以上色谱条件下，对供试品溶液在8 h之内每隔2 h进行考察，平行测定4次，结果槲皮素，山奈酚、咖啡酸和芦丁峰面积积分值的RSD(n=4)分别为2.32%、2.15%、2.23%、2.20%，测定结果表明4种多酚物质的含量在8 h之内保持稳定.

3.3.5 加样回收率试验

进行加样回收率试验以评价分析方法的准确性.精密称量白花蛇舌草样品0.3 g，共5份，每份分别加入1.0 mL标准溶液(质量浓度为0.2 mg/mL的槲皮素，0.5 mg/mL 的山奈酚，0.3 mg/mL的咖啡酸和0.4 mg/mL的芦丁)进行测定.槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁的平均加样回收率(n=5)分别为99.3%、99.4%、98.5%、98.7%，RSD分别为2.0%、1.84%、2.15%、1.90%.

表3 回收率测定结果(n=5)

3.4 样品的测定

准确称取2.0 g 白花蛇舌草样品3批，按“2.2”项下操作制备供试品溶液，取20 μL滤液进样进行测定，每批平行测定3次，用回归方程计算出槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁含量，结果见表4.

表4 白花蛇舌草中4种多酚含量的测定结果(n=3)

4 结语

本文用HPLC法同时测定了白花蛇舌草中4种多酚物质(槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁)的含量.实验结果表明，白花蛇舌草中槲皮素、山奈酚、咖啡酸和芦丁的含量分别为7.69，41.52，27.77，17.33 μg/g.该方法具有较好的准确度、精密度和重现性，提供了一种快速测定白花蛇舌中4种多酚物质的分析方法.