低氧诱导胶质瘤细胞上皮间质转化及差异表达的长非编码RNA的筛选*

唐尚鸿， 宋磊， 谢舒乐， 李群星， 林钊宇

1惠州市中心人民医院儿科(广东惠州 516001)； 2徐州医科大学第二附属医院口腔科(江苏徐州 221000)； 3中山大学孙逸仙纪念医院广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室(广东广州 510120)

低氧环境是实体瘤的一个普遍特征，尤其到肿瘤后期发展。低氧环境下肿瘤细胞往往会发生上皮间质转化(EMT)，从而促进肿瘤发生转移。恶性胶质瘤是中枢神经系统的高度浸润性肿瘤，其细胞从原发病灶迁移到周围正常脑组织和远处，中位生存时间<18个月[1]。这种胶质瘤的局部侵袭性对其临床预后较差至关重要，常常导致手术无法完全切除，导致原发灶复发、转移和播散[2-3]。因此，阐明神经胶质瘤转移的分子和生物学机制可能会发现新的治疗方法来治疗这种疾病。EMT是一种复杂的过程，其中上皮细胞失去细胞间接触并获得间充质特性，已被证明能够增强癌细胞的运动性、侵袭性和化疗耐药性[4]。缺氧是不同组织来源的人类癌症的普遍特征，包括胶质瘤[5]。然而，低氧诱导胶质瘤中EMT的机制仍不清楚。lncRNA被定义为长度超过200个核苷酸的RNA，并且从人类基因组转录，但不翻译(非编码)[6-7]。lncRNAs表现出组织特异性表达模式，并在肿瘤进展中发挥重要作用[8]。

1 材料与方法

1.1 细胞系及细胞培养 人神经胶质瘤U87和U251细胞培养在含有10% FBS(HyClone，Logan，UT，USA)的DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2常氧状态下进行培养。对于缺氧培养，将细胞置于37℃、5%CO2，1%O2和94%N2的密封培养箱中孵育。

1.2 实验分组 分为4个组。mock为空白对照组，NC-Si为阴性对照组，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-Si、HIF-1α-Si2为实验组。mock为仅加入转染试剂不转入任何载体。NC-Si为转染杂乱序列的小干扰RNA，HIF-1α-Si、HIF-1α-Si2为转染针对HIF-1α的目的序列干扰RNA。

1.3 长非编码RNA芯片检测 低氧诱导的胶质瘤细胞与亲本细胞系之间的lncRNA芯片分析由上海康成生物技术有限公司完成。

1.4 转染 转染前1 d选择对数生长期的肿瘤细胞于6孔板进行铺板，次日保证细胞贴壁生长良好。将合成好的siRNA与lipo3000脂质体介导的方式进行转染，6 h后换成普通培养基进行培养，转染48 h后提取蛋白及RNA进行下一步操作。

1.5 蛋白印迹实验 配胶完毕后，将蛋白样品变性后加入泳道，电泳完毕后，PVDF膜进行转膜，转膜完毕后，脱脂奶粉室温封闭1 h，将膜上所要检测的膜蛋白进行裁剪，4℃孵育抗体过夜，次日将膜置于TBST缓冲液进行漂洗，然后室温孵育二抗1 h，TBST缓冲液洗涤后发光液进行曝光。Western blot和qRT-PCR检测缺氧对EMT变化的影响。

1.6 定量实时PCR(RT-qPCR) 用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。接下来，使用引物将总RNA逆转录成cDNA，然后如下用特定引物组扩增：E-钙黏蛋白(E-cadherin)(正向)5′-GGAGGAGAGCGGTGGTCAAA-3′和(反向)5′-TGTGCAGCTGGCTCAAGTCAA-3′；波形蛋白(Vimentin)(正向)5′-GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT-3′和(反向)5′-TCCTCCGCCTCCTGCAGGTTCTT-3′； HOTTIP(正向)5′-AACGATGTGTGTGTGCCTTGAT-3′和(反向)5′-TGGTCCGACAGGGTGAATT-3′；GAPDH(正向)5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和(反向)5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；和U6(正向)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和(反向)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用比较循环阈值(Ct)(2-ΔΔCt)方法计算相对表达，对照组的表达设为1。

1.7 侵袭迁移实验 取对数期生长肿瘤细胞，将肿瘤细胞浓度控制在1×105个/mL，细胞迁移实验：1×105个细胞/200 μL无血清培养基接种于Transwell小室上室，下室加入500 μL含血清培养基，培养16 h后，棉签擦去上室内的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，冲洗，浸泡0.05%结晶紫染色5 min，PBS冲洗，倒置显微镜下观察计数。100倍放大倍数下，每个小室计10个视野，取平均值。细胞侵袭实验：首先将50 μL Matrigel(无血清培养基稀释1∶4，BD)加入Transwell小室上室，37℃孵育30 min，然后接种细胞进行下一步实验，培养时间为24 h，其余同前迁移实验。

2 结果

2.1 缺氧以HIF-1α依赖的方式诱导神经胶质瘤细胞发生EMT 在低氧条件下，胶质瘤U87细胞中波形蛋白的表达增加，而E-cadherin的表达则以时间依赖性方式显著降低。在U251细胞中观察到类似的结果(图1)。qRT-PCR结果进一步证实了mRNA水平的这些变化(图2)。在U87细胞中，侵袭和迁移能力增加了4.2～5.6倍，而在U251细胞缺氧下增加了4.3～4.2倍(图3、表1)。

图1 蛋白免疫印迹检测低氧条件下不同时间点U87和U251细胞EMT相关因子的表达

A:U87;B:U251;*与常氧比较P<0.01

A：U87细胞；B：U251细胞

缺氧条件下，U87和U251细胞的HIF-1α蛋白和mRNA水平都显着增加(图1、2)。HIF-1α的敲减消除了低氧对Vimentin上调的影响，并在蛋白质和mRNA水平都下调了E-cadherin的水平(图4、5)。侵袭迁移实验显示低氧对HIF-1α敲低的影响明显受到抑制(图6、表2)。

2.2 lncRNA芯片的筛选 在lncRNAs的不同表达中，HOTTIP是最多的上调缺氧处理胶质瘤细胞lncRNA，见图7。

细胞迁移能力侵袭能力U87常氧21±617±8缺氧87±972±5U251常氧42±1231±11缺氧141±16108±13

图4 蛋白免疫印迹检测胶质瘤细胞转染HIF-1α siRNA后HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表达变化

A:U87;B:U251;*与NC-Si比较P<0.05

A:U87;B:U251

细胞迁移能力侵袭能力U87NC-si116±1898±21HIF-1α-si132±1728±11HIF-1α-si242±1333±9U251NC-si127±23104±20HIF-1α-si130±619±5HIF-1α-si227±721±8

2.3 缺氧并转染HOTTIP siRNA对U87和U251细胞的侵袭和迁移能力的影响 低氧的胶质瘤细胞转染中HOTTIP siRNA，HOTTIP的表达水平被敲低，胶质瘤细胞的侵袭迁移能力被抑制。见图8、9及表3。

3 讨论

神经胶质瘤是颅内中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率在中国呈现上升趋势。虽然近年来治疗方法在不断改进，但因其恶性程度高、

A：低氧诱导细胞与亲本细胞之间的长非编码RNA芯片；B：qRT-PCR检测芯片结果的准确性

A：低氧诱导胶质瘤细胞与亲本细胞之间的长非编码HOTTIP的表达变化；*与常氧比较P<0.01；B：转染HOTTIP siRNA后HOTTIP的表达变化；*与mock、NC-Si比较P<0.01

图8 qRT-PCR检测低氧诱导及转染HOTTIP siRNA后胶质瘤细胞的表达

A：U87细胞；B：U251细胞

细胞迁移能力侵袭能力U87NC98±1083±8HOTTIP siRNA44±636±9U251NC134±12102±15HOTTIP siRNA46±838±4

增殖快、浸润性强，手术不能完整切除、放化疗不敏感，以致患者预后差。因此急需新的、更加精确的治疗手段来提高患者的疗效[9]。在实体瘤中，低氧是一种很普遍的现象，是肿瘤发生发展过程中一个重要的元素，低氧能够抑制多种实体瘤的增殖，促进侵袭等过程[10]。低氧引发的下游通路研究一直是一个研究热点，低氧可以引起HIF的产生，HIF进而促进多种基因的转录，表达多种蛋白以应对低氧环境[11]。以往对神经胶质瘤的研究主要集中与其发生发展密切相关的细胞异常分化、细胞增殖失调、细胞外基质降解、基底膜破坏等方面[12]。而近年关于非编码RNA的研究越来越多，使其成为肿瘤研究的热点[13]。其中lncRNA被发现可以参与肿瘤基因组的修饰、参与对靶基因的调控、结合特异性DNA或RNA进而对靶基因的表达进行转录激活和转录后调控。有文献[14]报道，在神经胶质瘤U87细胞系中发现lncRNA ATB可明显抑制神经胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移过程，这说明lncRNA ATB与神经胶质瘤的发生、发展可能存在密切关系。HOTTIP是一种新发现的lncRNA，越来越多的研究发现HOTTIP可能在肾癌、胰腺癌和乳腺癌中参与到调控肿瘤的增殖、凋亡和分化等方面，因此HOTTIP可能在癌症发生发展中起到重要的调控作用，然而在神经胶质瘤中lncRNA HOTTIP的作用机制仍不清楚。

本研究我们通过lncRNA芯片筛选发现，相比亲本细胞，低氧诱导后的神经胶质瘤细胞系中lncRNA HOTTIP表达水平明显升高，qRT-PCR验证发现lncRNA HOTTIP在低氧环境下的表达水平确实明显升高。低氧条件下，敲低HOTTIP表达水平时，发现神经胶质瘤U87和U251细胞系EMT的发生以及侵袭转移能力受到抑制，并发现在低氧条件时，神经胶质瘤是以依赖于HIF-1α的方式诱导了EMT的发生和侵袭转移能力。在人类实体瘤发生、发展中，缺氧是普遍现象。新近的证据显示缺氧在神经胶质瘤相关巨噬细胞浸润[14]、侵袭、迁移[15]和化疗耐药[16]中起着关键作用。此外，EMT已被证明是癌症转移过程中的关键步骤[6]。Quagliata等[17]报道在胶质瘤中缺氧诱导了肿瘤EMT的发生。而本研究中，我们进一步证实了HIF-1α可能参与调控缺氧诱导的神经胶质瘤的转移和EMT的发生。

总之，lncRNA在神经胶质瘤中起到重要作用，可以参与调控肿瘤的多种生物学行为。本研究通过RNA芯片筛选出lncRNA HOTTIP在恶性胶质瘤缺氧条件下表达水平明显升高，并通过细胞功能实验证实了lncRNA HOTTIP可能影响神经胶质瘤的迁移侵袭能力，并诱导EMT的发生。同时证实了HIF-1α可能参与调控缺氧诱导的神经胶质瘤的转移和EMT的发生。我们将进一步探究lncRNA HOTTIP是否通过调控HIF-1α，进而参与调控缺氧诱导的神经胶质瘤的转移和EMT的发生，为研究神经胶质瘤找到新的治疗途径。