利安辛与鸡马立克氏病疫苗混合使用的试验观察

张会霞 张 慧 孙芹芹 李 悦 姜胜男 曹胜亮

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

当前滑液囊支原体通过垂直和水平均可传播，并可长期带毒，是兽医临床上一种常见的、高发的传染病。鸡群一旦感染发病即难以彻底根除，而且药物治疗效果都不太理想，必须反复轮换用药，控制病情与继发感染[1]。盐酸大观霉素是氨基环醇类广谱抗生素，对革兰阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用[2]。林可霉素属林可酰胺类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病[3]。大观霉素及林可霉素均可与细菌核糖体亚基结合，能够有效抑制细菌蛋白质的合成，临床上常见配伍应用于细菌性疾病尤其是支原体病的预防及治疗，具有成本低、抗菌谱广、降低耐药性等优点。利安辛，是鲁抗利用自产原料盐酸大观霉素与林可霉素按2：1比例配伍的复方制剂，在控制鸡沙门氏菌，尤其是滑液囊支原体疾病方面疗效确切。为验证利安辛(盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉)对鸡马立克氏病疫苗免疫效果是否有影响，做了以下试验。

1 材料和方法

1.1 材料

鸡马立克氏活疫苗CVI988/Ripens株)及其稀释液购自乾元浩生物股份有限公司；利安辛(30g/瓶，盐酸大观霉素盐酸林可霉素可溶性粉)由山东鲁抗舍里乐药业有限公司高新区分公司提供，生产批号：1810001；SPF鸡胚购自济南家禽所。胎牛血清及PBS购自BI公司，DMEM培养基购自Gibco，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)及青链霉素混合液(100×)购自北京索莱宝。

1.2 试验分组

空白对照组：正常鸡马立克氏疫苗，不加任何抗生素；试验组一：100ml稀释液中加入3.75g利安辛；试验组二：100ml稀释液中加入5g利安辛。

1.3 试验方法

1.3.1 CEF细胞制备 选取9～11日龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF细胞，用5%FBS的培养基以5×106/ml的密度接入一次性100MM平皿培养20～24h确保细胞铺成单层，待细胞长至单层后将初代细胞用0.25%胰酶消化，以8×106/ml的密度铺至96孔板，在细胞长成单层后，进行接种疫苗。

1.3.2 准备疫苗及药品 鸡马立克氏病活疫苗(CVI988/Rispens株)从液氮罐中取出后立即按照常规使用方法稀释至工作浓度(病毒浓度约为3000PFU/0.2ml)，从稀释好的疫苗液中分别取出3份，100ml/份，然后向这3份稀释液液中依次迅速加入利安辛可溶性粉0、3.75、5g(相当于每羽份疫苗液中添加的利安辛分别为0、0.375、0.5mg)。

1.3.3 疫苗稀释及接种 96孔板弃掉培养基，PBS清洗2次，每孔加100ul1%FBS的维持液。然后分别取9个1.5ml高压过的离心管，在离心管中加入500ul维持液和500ul加入抗生素的疫苗稀释液，即2倍稀释，以同样的方法进行2倍逐级稀释，稀释至26。30min后取100ul稀释好的疫苗抗生素混合液，加入96孔板第二列(8个重复)，然后2倍逐级稀释至第12列，最后弃掉100ul。45min、60min按上述同样操作进行。放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养7d，观察每行的蚀斑情况，记录最后一个出现蚀斑的稀释倍数及蚀斑个数。马立克疫苗的效价通过蚀斑计数的方法进行计算，根据蚀斑数的平均值以及对应的稀释倍数，计算出MDV的含量，以每毫升病毒蚀斑形成单位(PFU)为单位[4]。

1.4 统计分析

将试验测得的数据应用软件SPSS23.0软件进行差异显著性检验，分别比较各作用时间点不同浓度利安辛添加组与未添加该药物的马立克疫苗空白对照组的差异以及同一药物处理组不同时间点的蚀斑数差异，各组间蚀斑变化差异采用单因素方差分析。

2 结果

在鸡马立克氏疫苗稀释液中加入利安辛可溶性粉之后，进行细胞实验蚀斑检测，并进行显著性分析，结果见附表，将数据用GraphPadPrism7作图分析，结果见附图。

附表 各试验组在各时间点的病毒蚀斑数 (PFU/ml)

结果分析表明：（1）在稀释好的100ml疫苗液中分别加入3.75g(试验组1)和5g(试验组2)利安辛，26℃作用30min和45min对疫苗病毒蚀斑数没有显著影响，但作用60min后，试验组一与未添加药物相比差异极显著(P＜0.01)。（2）随着添加药物浓度的提高，病毒蚀斑数的下降程度越来越严重。（3）无论是对照组还是实验组，随着作用时间的延长，病毒蚀斑数都有所下降。

附图 利安辛对马立克疫苗的影响

3 结论

利安辛，是鲁抗利用自产原料盐酸大观霉素与林可霉素按2：1比例配伍的复方制剂，在控制鸡沙门氏菌、大肠杆菌病尤其是滑液囊支原体病方面疗效确切。为了控制或净化鸡胚细菌感染，减少雏鸡的早期细菌感染，人们常将利安辛与鸡马立克氏病疫苗联合使用。前期临床用药证明利安辛与马立克疫苗联合应用对滑液囊支原体有良好的治疗作用，通过本试验数据显示，利安辛在一定剂量下对鸡马立克氏病疫苗效价没有显著影响，说明利安辛与鸡马立克氏病疫苗联合使用不会影响疫苗免疫效果。另外从本试验的数据也可以看出，在未添加利安辛的对照组，疫苗稀释后60min后测定的病毒蚀斑数也有所降低，建议疫苗在稀释后45min之内用完。