胶体金技术在免疫学检测中的应用

曹 雷 王增国 崔晓辰 胡士林

（①山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061 ②潍坊科瑞斯生物科技有限公司 山东 潍坊）

胶体金技术是80年代首先于免疫学领域发展起来的一门新技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法、免疫层析技术、生物传感器、PCR技术及染色体的基因定位的检测等生物学各个领域。目前已广泛应用于临床诊断，对医学临床检验、食品加工等产生了巨大影响。该方法最大特点是简单快速、准确直观，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。现将胶体金技术在某些领域的主要应用做一综述，希望能够给从事相关研究的工作者提供一些帮助。

1 胶体金技术基本原理

（1）在还原剂作用下，氯金酸(HAuCl4)水溶液中的金离子被还原成金原子，并聚集成一定大小的纳米金(nanogold)颗粒，在其表面吸附有负离子(AuCl2)和部分正离子(H+)形成吸附层，依靠静电作用形成稳定的胶体溶液，故称为胶体金。胶体金标记技术的物理基础是还原得到的金原子具有特殊的电子结构，在一些特殊的晶体面上存在着表面电子态，其费米能级恰好位于体能带结构沿该晶面的禁带之中，形成只能平行于表面方向运动的二维电子云[1]，使得胶体金颗粒具有高电子密度、介电特性、二次电子发射能力和催化作用等。金标过程实质上是蛋白质等大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，其原理一般认为是在pH值等于或稍偏碱于蛋白质等点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒之间静电作用较小，而蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于胶体金颗粒表面形成蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，从而使胶体系统处于稳定状态。（2）关于胶体金的制备已经有很多文献报道，其中最著名的是1857年Faraday等制备的金溶液历时几十年而稳定。目前比较经典的胶体金制备方法是柠檬酸钠还原法、抗败血酸还原法、白磷还原法等。还原剂的种类及浓度决定了金颗粒的粒径大小。JAN W.SLOT等通过制备PA/Au探针对上述三种方法进行比较，论证了还原剂、胶体金颗粒大小及实验效果之间的关系[2]。1971年，Faulk等将胶体金与蛋白质结合制成用于电子显微镜的金探针[3]，是胶体金应用于免疫细胞和组织化学的重要里程碑。此后胶体金逐渐应用于免疫化学，形成了四大免疫标记技术(荧光素、放射性同位素、酶和胶体金)之一的胶体金标记技术，并得到广泛应用。

2 胶体金技术概况

人们对胶体金的研究已有四百多年的历史，1857年Faraday等研究发现在胶体金溶液中加入少量电解质，溶液由红色变为蓝色，最终凝聚为无色，而加入明胶等大分子物质后便可以阻止该变化。这一重大发现奠定了胶体金应用的科学基础。1939年Kausche等用金颗粒吸附烟草花叶病毒并在电子显微镜下观察发现金离子呈高电子密度，之后Feldherr等于1962年首次提出胶体金可以作为电子显微镜的示踪标志物。1971年Faulk WP等用胶体金标记兔抗沙门氏菌血清，直接用于免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，开创了胶体金标记技术。1974年Romano等通过金标二抗(马抗人IgG)建立了间接免疫金染色法。此后，胶体金标记技术迅速发展，被广泛应用于各种生物大分子在细胞表面和细胞内部的定位、定性、形态发生和抗原特性等研究。1978年Geoghega等又将胶体金探针用于光镜水平测定细胞表面标志。但光镜下观察胶体金标记物，所需金颗粒要大于20nm，且标记物浓度要高这就限制了免疫金染色法(Immunogold Staining, IGS)在光镜水平推广应用。1981年Danscher等用银显影法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。后来，Holgate等根据Danscher的方法将免疫金染色法与银显影相结合，建立免疫金银染色法(Immunogold Silver Staining, IGSS)。1989年Spielberg F 等建立了斑点金免疫渗滤技术用于检测艾滋病病毒抗体[4]。近年来，随着人们对胶体金性质的深入理解，胶体金技术的应用已经由免疫学渗透到生物传感器、PCR技术及基因治疗等领域。

3 胶体金技术在免疫学检测中的应用

3.1 在电镜水平上的应用 胶体金作为免疫标记物最早用于电镜检测，主要是因为胶体金有很高的电子密度，在电镜下能显示清晰可辨的颗粒。抗原抗体复合物的电子密度与其背景电子密度差异较小，电镜下很难分辨这种结合，用高电子密度的胶体金标记抗体能增强显色结果，电镜下能准确的确定抗原分布。近年来胶体金技术在电镜水平上的应用已经从对组织细胞抗原定位研究发展到基因水平，主要体现在染色体的基因定位、基因表达的检测、特定核酸序列在细胞内的空间分布及核酸复制过程的定性和定量分析等[5，6]。如链霉亲和素-胶体金探针就能够在染色体上对DNA序列超微结构进行定位，可用于哺乳动物组织成长及相关疾病的实验室诊断。

3.2 在光镜水平上的应用 胶体金不仅可作为电镜水平的标记物，也适用于光镜水平，各种细胞涂片、切片均可应用。主要体现在：结合单克隆抗体技术检测细胞悬液或培养的单层细胞膜表面抗原[7]，检测培养的单层细胞胞内抗原及组织中或亚薄切片中抗原的检测。胶体金用于光镜水平研究，其优点是：不需要昂贵的荧光显微镜；弥补了其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点；用硝酸银可进一步提高显色效果。因此有取代传统的荧光素、酶和放射性物质标记的趋势。

3.3 胶体金同样也可以用于肉眼水平的检测，如凝集试验和胶体金免疫结合试验 （1）单分散的胶体金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化。当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，同时颗粒发生沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，变化的速度和程度与被测物的量相关，可用肉眼观察结果或测A580nm加以定量，后者灵敏度更佳。胶体金凝集试验的灵敏度优于胶乳凝集试验玻片法。（2）胶体金免疫结合试验基本上采用“抗体-抗原-抗体-胶体金”夹心法，其基本原理是以微孔滤膜为载体包被抗原或抗体，加入待测标本后，经滤膜毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金结合物达到检测目的。根据检测装置不同可分为斑点免疫金渗滤试验(dot immuno gold filtration assay, DIFA)和胶体金免疫层析试验(gold immunochromatography assay, GICA)[9]。（3）90年代以来，艾滋病感染人数已呈急剧上升趋势，对于艾滋病的检测和防治成为一个紧迫的课题。传统的检测方法主要采用酶联免疫反应(ELISA法)，但该法操作程序复杂、时间长、成本高，给实验室快速诊断带来不便。因此一种以胶体金为标记物用于检测艾滋病病毒抗体的渗滤试验由运而生，确立了DIFA基本技术。其基本原理是将待测液(如血清)滴在一种预吸附有HIV抗原的特殊滤纸上，待测液中的抗体与滤纸上的抗原特异性结合，然后滴入金标抗人免疫球蛋白探针(gold-antihuman-IgG)，抗人IgG结合抗体-抗原复合物，金颗粒被吸附在滤纸上而显色红色斑点，即为抗体阳性；反之，若无抗体，则金颗粒将全部通过滤纸不显斑点，即为抗体阴性(附图)。DIFA检测操作步骤与ELISA法相同，差别在于加样、反应、和洗涤均通过渗滤完成，检测全过程仅需几分钟，而灵敏度可达到ELISA水平。其原因在于：ELISA样品中待检抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗体(或抗原)反应，并且如果反应时间太短将降低灵敏度。而在膜渗滤法中，抗原充满膜的微孔，待测液层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩，从而提高了免疫效率。此外，研究发现金颗粒越小活性越高，灵敏度越好，但小于3nm的胶体金颜色浅，不利于肉眼观察。因此，必须选择合适粒径大小的胶体金，并结合一些信号放大系统[10，11]，尽可能提高灵敏度及延长保存时间。目前，夹心式抗体抗原法检测HIV抗体也已有报道，并已应用于临床诊断。免疫层析是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法[12，13]。胶体金免疫层析技术(GICA)是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，与DIFA不同点在于液体移动方向不是径向穿流，而是基于层析作用的横向流动。其原理是：以条行纤维层析材料为固相，样品由于毛细作用在层析条上泳动，此过程中样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，免疫复合物被富集或截留在检测带上，而游离标记物则越过检测带与结合标记物自动分离，通过可目测的胶体金标记物判断实验结果。研究表明微孔滤膜的选择、处理及受体的固定决定着免疫层析的质量：（1）在可选择的滤膜如硝酸纤维素膜、尼龙膜、羧化纤维素膜、聚脂膜、纯纤维素膜及玻璃纤维膜中，以硝酸纤维素膜(NCM)运用较多。这主要得益于NCM的两个特性：较高的蛋白质吸附容量和良好的亲水性。（2）受体的选择需要具备一下要求：能够与膜材料稳定结合；具有较高的生物活性，保证有足够的配体捕获容量；具有较高的纯度，保证特异性；具有良好的流动性，可在层析带上加入高效助溶剂、表面活性剂等。此外，受体包被量的选择，筛选和纯化抗体、制备标记物等也是不容忽视的重要环节。近年来该技术发展迅猛，正向高灵敏、多项检测和实现定量半定量等方向深入[14]。由此可见，在生物检测中胶体金取代三大传统标记物用于肉眼水平的检测，这除了胶体金本身具有的特点外还有以下原因：试剂和样本用量少，样本量可低至1～2µl；没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质；时间短，检测速度快；实验结果可以长期保存；不需γ-计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器。在以后的研究工作中，特别是在现地试验中将显示其巨大的优越性。

附图 胶体金探针检测HIV示意图

3.4 应用于流式细胞仪技术 应用荧光素标记的抗体通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但不同荧光素的光谱相互重叠，不能区分不同的标记，发展受到限制。因此，必须寻找一种非荧光素标记物用于流式细胞仪计数，从而可同时进行几种标记。Boehner等研究发现胶体金可以明显改变红色激光的散射角，他们将胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞仪分析不同细胞的表面抗原。结果发现，小鼠脾细胞可同时被荧光素和金标抗体标记，两者互不干扰，并且金标记的细胞在波长为632.8nm处，90度散射角可放大10倍以上。因此，胶体金可作为多参数细胞分析和分选的有效标记物，用于各类细胞表面标志与细胞内含物的分析。

3.5 应用于免疫印记技术 免疫印迹是一种比较新的免疫化学技术，是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜上，然后用酶免疫法，免疫荧光或放射免疫分析(RIA)法进行定量分析。胶体金也可用于该法的定量：转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体(一抗)作用后，再与金标二抗反应，充分漂洗后根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可对样品中的特异性抗原进行定量。不仅如此，胶体金还可以用于该法进行定位分析。杨中汉等人就利用此法对玉米精细胞膜特异糖蛋白进行了定位，并且结合银显影放大技术，可增强金颗粒的可见性，大大提高了测定灵敏度，检测下限可低至0.1ng[8]。胶体金应用于免疫印记技术具有一下优点：（1）信号本底比大；（2）无处理放射性同位素的麻烦；（3）结果可长期保存；（4）可采用银放大技术，灵敏度至少可提高10倍。

3.6 胶体金技术在其他领域中的应用 近年来，研究人员根据胶体金的物化性质，进一步扩展了胶体金标记的生物检测技术。（1）胶体金颗粒独特的生物效应、介电特性使得该技术在生物传感器中的研究增多。葡萄糖氧化酶(GOD)薄膜可以作为测定血糖的生物传感器，胶体金技术的引入大大增强了酶膜的活性[15,16]。研究发现，金的氧化还原电位为+1.68，有极强的夺电子能力，对于那些氧化还原电位较小的生物大分子参加的生化反应具有很强的催化作用，能明显提高生物大分子生物活性。同时，胶体金在表面等离子体基元共振(SPR)中的应用显著的增强了SPR的灵敏度[17]。Lyon LA等采用胶体金或金标生物大分子修饰金膜，构造SPR检测系统的敏感薄膜，从而检测到具有较大偏移的反射波谷，达到对SPR的放大作用[18]。Andrew通过对不同粒径胶体金修饰的SPR进一步研究发现胶体金颗粒大小对SPR的响应有很大影响：胶体金颗粒越大相应的SPR曲线变化越明显。（2）胶体金密度比较大，金标抗体/抗原与相应抗原/抗体结合后，复合物质量有较大变化，可以用来提高石英晶体微天平(QCM)技术在DNA检测方面的灵敏度[19]。虽然当前这种灵敏度只能提高2-3倍左右，但金标抗体能形成分子量巨大的复合物，所以在这方面有很大的应用潜力。同时，胶体金颗粒具有良好的导热特性，可以有效的提高PCR效率。Min Li等发现向PCR反应体系中加入一定量(0.7nM)粒径为13nm的胶体金颗粒后，冷热转换率大大提高、反应时间缩短，且不影响产物量。研究发现，胶体金颗粒的加入可以使普通PCR检测灵敏度提高5～10倍，而对于适时定量PCR至少提高104倍[20]。胶体金的引入对于降低成本、提高反应效率和灵敏度具有重要意义。（3）胶体金具有良好的生物相容性以及极高的比重，可以作为基因运载体应用于基因治疗，提高了基因导入的瞬时性和表达效率。人们对胶体金颗粒的免疫原性进行试验研究发现，胶体金在半抗原载体和免疫增强佐剂方面也具有重要作用[21]。用胶体金作为半抗原载体来免疫实验动物，可增强机体非特异性免疫反应，提高巨噬细胞吞噬作用；而胶体金作为佐剂对DNA疫苗的电穿孔扩张具有免疫增强作用。另外，研究还发现胶体金在肿瘤放射疗法方面也具有重要意义[22]。

4 胶体金技术的优缺点

（1）胶体金标记技术与免疫荧光、酶技术、免疫铁蛋白、放射性同位素等标记技术相比有其独特的优越性和更广泛的用途。 胶体金标记即可用于常规光镜，也可用于荧光显微镜，其中光镜应用的IGSS法是迄今最敏感的免疫组化方法。同时由于金颗粒具有很强的激发电子能力，还可用于扫描电镜和X射线衍射分析等。胶体金是高电子密度颗粒性标记物，电镜下分辨率高，对超微结构遮盖少，并易与其他颗粒性结构相区别，具有较精确的定位能力。利用不同直径胶体金颗粒标记不同抗原，可实现电镜下的双重或多重免疫标记。（2）免疫胶体金制备不需经过化学反应交联，多种生物大分子均可与金颗粒吸附形成复合物，且生物大分子活性保持不变。免疫金应用于免疫层析快速诊断技术，大大提高了检测速度，准确可靠，特异性强，灵敏度高，检测下限可达到1ng/ml；无污染，不含放射性同位素、邻苯二胺等有害物质；成本低廉，操作简单，无需附加设备等，非常适合医院、养殖场、诊所和家庭等。但也曾有报道称胶体金免疫层析快速诊断试纸条存在假阳性和漏检率高的问题。假阳性或若阳性其主要原因是由于检测时间过短，一般时间为5～10min；也有可能是强阳性样品造成的拖带现象；同时外界条件如温度、湿度对其也有一定的影响。

5 结语

胶体金标记对生物分子的活性影响较小，且能标记很大一部分生物分子，是非常理想的标记物。胶体金颗粒独特的物理效应和化学效应使其在生物学、免疫学和医学等领域得到广泛应用。随着科学研究的不断深入发展，基于胶体金应用的新技术、新方法即将问世，为科学研究及临床诊断开辟新的途径。今后，胶体金技术在生物检测及医学研究等领域会有更好的发展前景。