渗透压对林可霉素发酵效价影响的研究

＊陈东 郭佳 马思丽

（宁夏泰益欣生物科技股份有限公司 宁夏 750205）

林可霉素（Lincomycin）是一种林可胺类抗生素，是由林可链霉菌发酵产生的次级代谢产物。1962年，Mason等人从美国林肯市的土壤中发现了一种放线菌，并从该菌中分离得到了林可霉素。由于林可霉素对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性球菌及厌氧菌具有良好的抗性，因此在临床治疗中被广泛应用[1]。

林可霉素是由甲硫林可胺与丙基脯氨酸通过肽键链接而成的，包括林可霉素A、林可霉素B、林可霉素C、林可霉素D、林可霉素S和林可霉素K等，其化学结构式如图1和表1所示。通常所说的林可霉素是指林可霉素A，其分子式为C18H34N2O6S，分子量为406.56。林可霉素A具有良好的抗菌效果且毒性较低，而林可霉素B因有较大毒性且抗菌活性低，因此常被用作评价林可霉素原料药质量的一项重要指标[2]。

表1 林可霉素组分结构一览表

表2 实验仪器

图1 林可霉素结构图

目前国内外关于提高林可霉素A产量及降低林可霉素B含量的相关报道中，主要研究集中于培养基优化，包括在发酵过程中直接添加前体、氨基酸、甲基化试剂等[3]，但通过添加盐调节渗透压是否会提高林可霉素A产量及降低林可霉素B含量的报道相对较少。本研究通过添加不同质量分数的NaCl（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%）调节发酵液渗透压，测定林可霉素A和林可霉素B效价，探究渗透压对林可霉素发酵的影响，并在最适渗透压条件下比较了甘油、脯氨酸和甜菜碱三种渗透压保护剂对林可霉素效价的影响，以期确定提高林可霉素A效价及降低林可霉素B效价的最适渗透压范围和最适渗透压保护剂及其质量分数，为林可霉素的工业化生产奠定基础。

1.仪器与试剂

(1)试剂

葡萄糖、玉米浆、有机硅消泡剂、聚醚类消泡剂，均为工业级，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、磷酸二氢钾、硝酸钠、硫酸铵、氯化钠，均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；碳酸钙，分析纯，生工生物工程（上海）股份有限公司；甘油，分析纯，上海泰坦科技股份有限公司；甜菜碱、脯氨酸，均为分析纯，Sigma；黄豆饼粉，工业级，实验室自备。

(2)仪器设备

2.材料与方法

(1)实验材料

林可链霉菌菌种由宁夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

(2)实验方法

高效液相色谱法（HPLC）测定林可霉素A与林可霉素B效价。

3.结果与分析

(1)渗透压对林可霉素发酵的影响

在生物发酵过程中，菌体会受到各种因素的刺激，如氧化还原、营养物质饥饿、高温、低温等，这些因素会影响菌体的生长、生产以及代谢过程[4]。已有研究显示，一些与渗透响应有关的产物，若将培养基的渗透压调至合适区间，则有助于目的产物的积累。目前相关研究主要是通过向发酵液中添加一定质量分数的NaCl、KCl和葡萄糖调控渗透压。本研究是以NaCl为渗透压调节剂，探究渗透压对林可霉素发酵的影响。

NaCl初始添加质量分数为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%，并进行10天的发酵，结果如表3所示，随着NaCl质量分数的增加，发酵液渗透压也逐渐增大，这说明渗透压与钠离子质量分数成正比。在NaCl质量分数为0～1.0%时，随着渗透压的增大，林可霉素A的效价逐渐上升，林可霉素B的效价逐渐下降，在NaCl质量分数为1.0%～2.5%时，随着渗透压的增大，林可霉素A的效价逐渐下降，林可霉素B的效价逐渐上升。因此，在NaCl质量分数为1.0%时（渗透压1.082 Osmol/kg）效果最好，林可霉素A效价达到最大值11426μg/mL，较对照组10461μg/mL提高了9.22%，林可霉素B的效价达到最小值16μg/mL，较对照组26μg/mL降低了38.46%，在后续实验中以1.0% NaCl作为渗透压调节剂的最适添加质量分数。

表3 不同质量分数的NaCl对林可霉素发酵的影响

(2)渗透压保护剂的选择

渗透压保护剂是一种相容性溶剂，能有效保护微生物在极端渗透压环境中膜的完整性和细胞结构的稳定性，保证微生物在极端渗透压环境中也能存活[5]。在高渗环境中，微生物可以通过渗透压应激响应在细胞内合成渗透压保护剂，也可以从环境中摄取部分渗透压保护剂，使微生物细胞内外渗透压达到平衡[6]。为了降低林可链霉菌在高渗环境中的不适，本研究分别向发酵液中添加了甘油、脯氨酸和甜菜碱这三种常见的渗透压保护剂，并分析比较了这三种渗透压保护剂对林可霉素A和林可霉素B效价的影响。

甘油对林可霉素效价影响的结果如图2所示，林可霉素A的效价随甘油质量分数的增大呈先上升后下降的趋势，在甘油质量分数为0.5%时，林可霉素A的效价最高为11978μg/mL，较CK组（10461μg/mL）提高了14.50%，较1.0% NaCl组（11426μg/mL）提高了4.83%，林可霉素B的效价随甘油质量分数的增大呈先下降后上升的趋势，在甘油质量分数为0.5%时，林可霉素B的效价最低为12μg/mL，较CK组（26μg/mL）降低了53.85%，较1.0% NaCl组（16μg/mL）降低了25.00%。上述结果表明0.5%甘油对提高林可霉素A产量和降低林可霉素B含量效果最优。

图2 不同质量分数的甘油作为渗透压保护剂对林可霉素发酵的影响

脯氨酸是一种非常重要的胞内可溶性物质，除了在胞内自身合成外，还可以从外界环境中获取，其生理功能主要包括增加细胞蛋白质和膜的稳定性，作为共同氮源或碳源进入细胞代谢以及作为抵御外界高渗环境[7]，因此选用脯氨酸作为林可霉素发酵过程中的渗透压保护剂，研究其对林可霉素A和林可霉素B效价的影响，结果如图3所示，林可霉素A的效价随脯氨酸质量分数的增加呈先上升后下降的趋势，在脯氨酸质量分数为0.25%时，林可霉素A的效价最大为12123μg/mL，较CK组（10461μg/mL）提高了15.89%，较1.0% NaCl组（11426μg/mL）提高了6.10%，林可霉素B效价随脯氨酸质量分数增加呈先下降后上升的趋势，在脯氨酸质量分数为0.25%时，林可霉素B的效价最小为11μg/mL，较CK组（26μg/mL）下降了57.69%，较1.0% NaCl组（16μg/mL）降低了36.36%，上述结果表明0.25%脯氨酸对提高林可霉素A产量降低林可霉素B含量效果最优。

图3 不同质量分数的脯氨酸作为渗透压保护剂对林可霉素发酵的影响

甜菜碱是一种氨基酸甲基取代物，存在于几乎所有微生物体内且渗透效能很好，因此是常用的一种渗透压保护剂[8]。结果如图4所示，随着甜菜碱质量分数的升高林可霉素A的效价呈先上升后下降的趋势，在甜菜碱质量分数为0.25%时，林可霉素A的效价最高为11997μg/mL，较CK组（10461μg/mL）提高了14.68%，较1.0% NaCl组（11426μg/mL）提高了5.00%，林可霉素B的效价随甜菜碱质量分数的增加呈先下降后上升的趋势，在甜菜碱质量分数为0.25%时，林可霉素B效价最低为12μg/mL，较CK组（26μg/mL）降低了53.85%，较1.0% NaCl组（16μg/mL）降低了25.00%，上述结果表明0.25%甜菜碱对提高林可霉素A产量降低林可霉素B含量效果最优。

图4 不同质量分数的甜菜碱作为渗透压保护剂对林可霉素发酵的影响

4.结论

本文以NaCl为渗透压调节剂研究渗透压对林可霉素发酵的影响，并在最适渗透压条件下分析了甘油、脯氨酸和甜菜碱三种渗透压保护剂对林可霉素效价的影响。结果表明，随NaCl质量分数的增加，渗透压逐渐增大，表明渗透压与钠离子质量分数成正比；林可霉素A的效价随渗透压的增大呈先上升后下降的趋势，林可霉素B的效价随渗透压的增大呈先下降后上升的趋势，且在渗透压为1.082 Osmol/kg（1.0% NaCl）时，林可霉素A效价最高，林可霉素B效价最低。因此，以1.0% NaCl作为渗透压保护剂的筛选条件，筛选最适渗透压保护剂及质量分数，发现在甘油质量分数为0.5%时林可霉素A效价显著高于对照组，林可霉素B效价显著低于对照组，脯氨酸和甜菜碱都是在0.25%时林可霉素A效价显著高于对照组，林可霉素B效价显著低于对照组。因此在适宜质量分数下三种渗透压保护剂都可以有效提高林可霉素A产量降低林可霉素B含量，且比较发现0.25%脯氨酸＞0.25%甜菜碱＞0.5%甘油。综上所述，在1.0% NaCl+0.25%脯氨酸时可以有效提高林可霉素A产量降低林可霉素B含量。