重组鸡γ-干扰素联合鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫效果的研究

刘晓婧 魏 波 蒋贻海* 曲信芹

（①青岛蔚蓝生物股份有限公司 山东 青岛 266061 ②青岛动保国家工程技术研究中心有限公司山东 青岛 ③青岛蔚蓝生物制品有限公司 山东 青岛）

鸡新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性高度接触性传染病[1]。禽流感(AI)则是由A型流感病毒(AIV)引起的严重侵害禽类呼吸系统和生殖系统的一种传染病[2,3]。二者均属于必须防控的重要疫病，对我国养禽业造成了巨大的经济损失。干扰素(interferon，IFN)具有抑制病毒复制和调节机体免疫反应的功能[4]，由于没有耐药性和药物残留的风险，并具有广谱的抗病毒活性，而且重组干扰素和天然干扰素同样具有抗病毒能力和免疫调节活性，因此重组干扰素在病毒类疾病的防治中的应用及其机理研究成为了目前的研究热点[5]。

目前，禽类干扰素主要通过作为免疫增强剂或者直接使用来发挥生物学功能。据文献报道，鸡γ-干扰素分别对鸡新城疫活疫苗和禽流感(H5亚型)灭活疫苗有免疫增强效果[6,7]，故笔者选择本公司的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)与重组鸡γ-干扰素联合免疫，验证其免疫增强效果以期鸡群在免疫后获得更好的免疫保护。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 1日龄SPF鸡购自于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，隔离器中饲养。

1.1.2 疫苗 鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)由青岛蔚蓝生物制品有限公司提供。

1.1.3 主要试剂 鸡IL-4(ChIL-4)和鸡IFN-γ(ChIFN-γ)夹心ELISA检测试剂盒购自河北天顺生物科技有限公司；重组鸡γ-干扰素由青岛蔚蓝生物制品有限公司制备；鸡新城疫HI实验标准抗原和阳性血清均购自中国兽医药品监察所；H9亚型禽流感HI标准抗原和阳性血清均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组 将1日龄SPF鸡在隔离器中饲养，随机分成3组，每组10只，分别是鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗和鸡 γ-干扰素联合免疫组(A)，鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫组(B)和空白组(C)。各组分别在7和14日龄各免疫1次，除A组免疫剂量为1mg/ml的重组鸡 γ-干扰素0.2ml和0.3ml鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗外，其余各组均为0.3ml。空白组(C)只注射生理盐水。免疫途径为肌肉注射。

1.2.2 样品采集及处理 （1）细胞因子检测：免疫后24、48h所有鸡采全血，分别用鸡IL-4(ChIL-4)和鸡IFN-γ(ChIFN-γ)夹心ELISA检测试剂盒检测不同组试验鸡的血清中细胞因子的含量。（2）体液免疫检测：采集免疫后7、14、21、28、35d的血清，按照《中华人民共和国兽药典》附录中血凝抑制标准检测方法[8]，分别测定ND和AI(H9亚型)抗体水平，记录实验结果。最终用Excel、SPS S 20.0等软件，对检测结果进行数据整理、统计分析。

2 结果与分析

2.1 细胞因子检测结果

免疫后24h和48h检测鸡体产生IFN-γ和IL-4细胞因子水平结果如图1、2(单位：pg/ml)。

通过检测免疫后24h和48h IFN-γ和IL-4细胞因子水平可以看出，A组在24h和48h的IFN-γ水平检测均明显高于B组和C组；IL-4在24h时细胞因子水平明显高于B组和C组，说明重组鸡γ-干扰素能刺激鸡体快速产生免疫应答反应。

图1 细胞因子IFN-γ检测结果

图2 细胞因子IL-4检测结果

2.2 体液免疫检测结果

各试验组鸡在免疫后的抗新城疫和禽流感H9亚型的HI 抗体效价分别如表1和表2所示。

表1 实验动物抗新城疫HI滴度检测结果 (nlog2)

表2 实验动物抗禽流感H9亚型HI滴度检测结果 (nlog2)

由表1和表2可知，在免疫后A组和B组抗新城疫和禽流感H9亚型的抗体效价涨落趋势基本一致，A组的抗新城疫和禽流感H9亚型抗体滴度均在免疫后21d达到高峰而B组则在28d达到高峰。C组在试验过程中均无抗体产生。

试验结果表明，A组的抗新城疫抗体效价在免疫后7、14、21、28和35d均高于B组；而A组的抗禽流感H9亚型抗体效价则在免疫后21、28和35d高于B组。由此可知，鸡γ-干扰素与鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗联合免疫的免疫增强效果显著。

3 讨论

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗是目前家禽养殖行业中应用比较广泛的禽类疫苗，相较于活苗其安全性更可靠，但抗原被灭活后会在一定程度上影响免疫效果[6,9]。而细胞因子作为免疫增强剂能够克服其他常规佐剂所引起的毒性大、难以吸收等缺点，因此，许多细胞因子已经被用来作为疫苗佐剂[6,10-12]。本试验采用重组鸡γ-干扰素作为鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗的增强剂。从细胞因子检测结果来看，重组鸡γ-干扰素和灭活疫苗的联合免疫相较于其他两个试验组能在短时间内达到较高的细胞因子水平，说明重组鸡γ-干扰素能加快鸡体内产生免疫应答反应的速度。从体液免疫检测结果来看，重组鸡γ-干扰素和灭活疫苗联合免疫刺激机体所产生的针对鸡新城疫和禽流感H9亚型的抗体水平均高于单独免疫灭活苗所达到的抗体水平；并且相较于单独免疫灭活苗组，使用重组鸡γ-干扰素联合免疫能促使机体快速达到较高的抗体水平，进一步说明了重组鸡γ-干扰素能有效增强鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗的免疫效果。

4 小结与展望

目前我国禽类养殖行业仍被许多烈性传染性疾病所困扰(如禽流感、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、新城疫等)，养殖户每年都要面临遭受巨大经济损失的风险。而新疫苗开发周期长，化学药品的使用又易产生耐药性并导致药残。干扰素作为一种细胞因子，已在许多研究中证明是机体抗病毒感染防御反应中出现最早且对大多数病毒均有作用的广谱抗病毒药物[5]。雏鸡的首免日龄是7日龄，在其母源抗体水平逐渐降低且疫苗免疫后尚未产生能达到保护效力的抗体时干扰素的作用尤为重要，因其能快速刺激机体产生相应的免疫保护因子，促进机体免疫应答反应，最终能达到提高鸡群存活率的效果。在实验过程中笔者还对免疫前后各试验组的体重增重情况进行了记录，结果发现联合免疫组相较于其他两组在增重比上也略有优势，说明干扰素的使用对鸡体生产性能的提高也有一定的帮助。笔者相信随着基因工程技术的发展，重组干扰素的在禽类疫病防控中的应用也会越来越广泛。