标准加入法测定猪肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶残留量

杨修镇 尹伶灵 陈 玲 张呈军 牛华星 刘少宁

（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室 山东 济南 250022）

标准加入法是指取一定量被测物质标准溶液精确加入到待测样品中，根据加入被测物质标准溶液前后仪器测定响应值来计算待测样品中被测物质量的一种方法。依据：A前/A后=X前/(X前+X加入) 得出：X前＝X加入/[(A后/A前)－1]式中：A前为加入被测物质标准溶液前待测样品的仪器响应值；A后为加入被测物质标准溶液后待测样品的仪器响应值；X前为待测样品中被测物质的量(未知)；X加入为待测样品中加入被测物质的量(精确加入)。

在分析中为了消除样品基质干扰，提高测定准确度，往往推荐标准加入法，这种方法在原子吸收分光光度法、离子选择性电极法、分光光度法、极谱法、气相色谱法中应用尤多[1～3]。本实验室2018年6月参加农业农村部农产品质量安全监管局组织的猪肉中磺胺类药物残留量能力验证考核时，按照GB/T 20759-2006进行了检测，检出阳性药物磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶。但由于组织方未提供空白样品本底，本实验室自行选取的本底与考核样品出现基质不匹配，致使定量结果异常。由于缺乏被测药物同位素内标无法采用内标法消除基质效应影响，故采用标准加入法测定了猪肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶残留量。采用该方法后，本实验室取得了满意定量结果并顺利通过能力验证考核。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串联质谱仪；电子天平(感量0.01g、0.00001g)；均质机；涡旋混合器；旋转蒸发仪；离心机；有机滤膜(0.22µm)；磺胺二甲嘧啶标准物质(德国Dr公司，含量≥98%)；磺胺二甲氧嘧啶标准物质(德国Dr公司，含量≥98%)；生鲜猪肉(购于超市)；乙酸铵为优级纯，乙腈、甲醇、异丙醇、正己烷为色谱纯；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液配制

精密称取磺胺二甲嘧啶标准物质和磺胺二甲氧嘧啶标准物质各10mg，置同一10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/ml的混合标准贮备液。精密量取混合标准贮备液500µL，置100ml容量瓶中，用10%乙腈溶液稀释至刻度，配制成浓度为5µg/ml的混合标准溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 加入被测物质标准溶液前样品前处理 根据参考文献[4]方法，称取试样5.0g(精确至0.01g)置50ml离心管中，加入20g无水硫酸钠和20ml乙腈，均质2min，以8000r/min离心3min，上清液倒入100ml鸡心瓶中，残渣加入20ml乙腈，重复上述操作一次。合并提取液，向鸡心瓶中加入10ml异丙醇，用旋转蒸发仪于50℃水浴蒸干，准确加入1ml 10%乙腈溶液和1ml正己烷溶解残渣。转移至5ml离心管中，涡旋1min，以8000r/min离心3min，吸取上层正己烷弃去，再加入1ml正己烷，重复上述步骤，直至下层变成透明液体。取下层溶液，过0.22µm滤膜，供上机测定。

1.3.2 加入被测物质标准溶液后样品前处理 称取试样5.0g(精确至0.01g)置50ml离心管中，精确加入5µg/ml的混合标准溶液100µl后，自“加入20g无水硫酸钠和20ml乙腈”起按加入被测物质标准溶液前样品前处理方法制备，即得。

1.4 测定方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：C1850mm×2.1mm，粒径1.7µm；流动相：A相为乙腈，B相为0.01mol/L乙酸铵溶液；流速：0.3ml/min；进样量：2µl；柱温：35℃；洗脱条件如表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.4.2 质谱条件 根据参考文献[5～7]方法，电离模式：电喷雾正离子(ESI+)，毛细管电压：3v，离子源温度：150℃，脱溶剂温度：350℃，脱溶剂气流速：550L/h.，脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮，采集方式：多反应监测(MRM)，磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的定性和定量离子见表2。

表2 磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶特征离子参考质谱条件

1.4.3 方法的准确度和精密度 采用标准添加法，取3批空白猪肉，每批中添加磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶50、100、200µg/kg 3个不同浓度(添加量分别为1/2MRL、MRL、2倍MRL)，每个浓度进行6份，其中1份按加入被测物质标准溶液前样品前处理方法制备，5份按加入被测物质标准溶液后样品前处理方法制备，经高效液相色谱－串联质谱仪测定，按标准加入法计算回收率。

2 结果与分析

2.1 准确度和精密度

在空白猪肉中添加3个不同浓度的磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶后按标准加入法进行回收率试验，结果见表3。

表3 猪肉中磺胺二甲嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶的添加回收率

2.2 能力验证考核样品结果

本实验室首先按照GB/T 20759-2006对能力验证考核样品进行了检测，由于组织方未提供空白样品本底，存在自行选取的本底与考核样品出现基质不匹配带来定量不准确的风险。本实验室又采取标准加入法进行了测定，结果表明两种定量方法测定的数值存在较大差异。本实验室以标准加入法的结果进行了上报，顺利通过了能力验证，结果见表4。

3 讨论与小结

液相色谱串联质谱法由于高分离效能、高选择性和高灵敏度适用于复杂样品中药物及其代谢产物的测定，其中以电喷雾电离(ESI)方式应用最为广泛，其电离方式固有的基质效应问题也逐渐引起人们的关注。基质效应的产生源于待测组分与样品中的基质成份在雾滴表面离子化过程的竞争，其竞争结果会显著降低或增强目标离子的生成效率及离子强度，进而影响测定结果的精密度和准确度[8]。由于基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度与标准品相比有显著不同，为平衡这种差异2010年以前发布的检测标准大多采用基质匹配标准曲线法。但在实际检测中，因所测样品具有不同的来源(例如我国生猪品种多达60多种，饲养技术及饲养环境也是千差万别[9,10]，同时受屠宰、运输、保存等影响)，使得样品基质与基质匹配标准溶液的基质仍有较大差异，使得含同样浓度目标化合物的不同来源样品的测定结果大不相同。为解决这一问题同位素内标法被广泛采用，由于被测化合物与其同位素内标具有几乎完全一致的化学性质和不同的质荷比，不但可以平衡基质效应的影响还可以减少前处理的操作误差和系统误差。但是同位素内标往往比较昂贵或者难以获得，在不具备同位素内标的情况下仍需获得准确定量结果时就需要采用标准加入法。标准加入法由于是在样品本身中进行添加，其同样可以平衡基质效应的影响，但依据其定量原理，操作往往较为复杂，标准溶液加入前及加入后均需准确测定，对操作者的要求较高。

本文主要是在GB/T 20759－2006的基础上变换定量方法，因此着重对准确度和精密度进行了研究未对专属性、线性范围、检出限等一致内容进行累述。采用标准加入法定量之前需先对样品进行预试验来评估样品中被测物质的量，加入量宜与样品中的量接近，如差距甚远仍会使定量不准确。