温脾通络开窍汤对老年性痴呆大鼠学习记忆能力及海马CA3区JNK蛋白表达的影响

黄晓丹 ，吴 林 ，刘 璐 ，吕 燕 ，陈 炜 ，王清碧

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001；3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

老年性痴呆（alzheimer disease，AD）是以学习记忆障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病［1］。目前，它已经成为继心脏病、肿瘤、脑卒中后引起成人死亡的第四位病因［2］，因此，及早发现并干预治疗极其重要。研究表明，细胞凋亡是AD的发病机理，在细胞凋亡过程中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）信号途径是其关键环节［3］。痰浊瘀血阻窍是老年性痴呆的关键病机，本课题组在临床上应用温脾通络开窍汤治疗老年性痴呆疗效良好。为进一步探讨温脾通络开窍汤治疗AD的作用机制，本实验通过在大鼠海马CA3区注射冈田酸诱导老年性痴呆动物模型，用Morris水迷宫检测AD大鼠的学习记忆能力，并采用Western blot技术检测海马CA3区神经元JNK蛋白的表达变化，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 120只SPF级雄性SD大鼠，体质量250±30 g，购于广西医科大学动物实验中心，合格证号：0006453；饲养条件：室温控制在22℃左右，自由饮食、进水。

1.2 试药与试剂 温脾通络开窍汤由黄芪30 g、益智仁 10 g、三七 10 g、石菖蒲 10 g、何首乌 10 g、绞股蓝10 g组成，由江苏江阴天江药业有限公司提供中药配方颗粒（广西中医药大学第一附属医院统一购置）。石杉碱甲为浙江震元制药有限公司产品（规格：每片50μg；批号：120303）；冈田酸（OA）为美国 Sigma公司产品（批号：04511）；二甲亚枫（DMSO）为 Amresco公司产品（批号：120303）。

2 方法

2.1 造模方法 120只大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、石杉碱甲组，每组20只。大鼠予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉后放在脑立体定位仪上固定。参照大鼠脑立体定位图谱［4］，以右侧海马CA3区（前囟后3.0mm，中线右侧旁开2.2mm，深度为颅骨下2.7mm）为注射靶点，注射0.4 mmol/L的冈田酸（用10%的二甲亚砜溶解配制）5μl，留针10 min，使药物充分弥散吸收。隔天注射1次，共7次。假手术组手术步骤同上，于相同部位注射等体积的10%二甲亚砜。术后伤口适量用红霉素软膏外涂，并予每只大鼠腹腔注射8万U青霉素钠预防感染。

2.2 给药方式 中药低、中、高剂量组给予温脾通络开窍汤灌胃，剂量分别为 4.15 g/kg、8.30 g/kg、16.90 g/kg，灌胃容积为10 ml/kg体重；石杉碱甲组予石杉碱甲溶液（片剂研末后以双蒸水调配）灌胃给药，剂量为0.003 g/kg，灌胃容积为 10 ml/kg 体重；假手术组、模型组经灌胃针予相同容量的生理盐水。每日1次，连续灌胃30天。以上干预措施均以30天为观察周期。

2.3 空间探索实验 末次给药禁食24 h后，参考Gong等［5］方法，将水池等分为4个象限，并在第4象限中心放置一低于水面3 cm的黑色圆形平台为逃生平台，水温25℃左右，保持水池周围的参照物不变。由水迷宫上方2 m处的监视录像机追踪大鼠的逃避潜伏期时间、运动轨迹、空间探索中的跨越平台次数，设定记录时间为60 s，如超过60 s内未找到逃生平台，则引导大鼠上平台停留10 s。前5天每天1次，分别在4个象限训练1次，每次训练间隔60 s，定位航行结束后撤掉平台，记录60 s内其跨越逃生平台的次数，取每只大鼠4个象限的平均成绩作为总成绩。

2.4 Western blot实验 行为学测试结束后，采用心脏灌注后取脑的方法，用10%的水合氯醛（3 ml/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉，消毒，并立即开胸暴露大鼠心脏，进行心尖快速灌注0.9%氯化钠溶液，使肝脏变为白色或右心耳处流出的液体基本清澈后即可停止灌注，并采取冰台上断头取新鲜的脑组织置入液氮中存放。取海马CA3区组织，剪下约3 mm厚，用液氮研磨，研磨好备用。制备SDS-PAGE胶，上样，连接电源，设定恒压为60 V，30 min之后恒压为80 V，电泳1.5 h。免疫印迹检测：用封闭液室温封闭膜2 h；孵育一抗，冲洗；孵育二抗，用PBST洗膜3次。将X光片置于显影液中，显好条带后取出清洗，并在定影液中将其定影。取出待干后扫描。

2.5 统计学方法 采用SPSS20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠在空间探索实验中的跨越平台次数比较 见表1。

表1 各组大鼠跨越平台次数比较 （±s）

表1 各组大鼠跨越平台次数比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01；与石杉碱甲组比较，④P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg） 跨越平台次数（次）假手术组 20 — 8.21±2.11模型组 20 — 3.82±1.05①石杉碱甲组 20 0.003 6.95±1.56③中药低剂量组 20 4.15 4.53±1.13②④中药中剂量组 20 8.30 5.12±1.72②④中药高剂量组 20 16.90 7.02±1.09③

表1显示，与假手术组比较，模型组大鼠在空间探索实验中跨越平台的次数明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组均能增加大鼠跨越平台的次数（P＜0.05 或 P＜0.01）；与石杉碱甲组比较，中药低、中剂量组大鼠跨越平台的次数明显减少（P＜0.01），而中药高剂量组大鼠跨越平台的次数与石杉碱甲组无显著性差异（P＞0.05）。

3.2 各组大鼠海马CA3区JNK蛋白阳性表达量比较见图 2、表 2。

图2 各组大鼠JNK蛋白条带图

表2 各组大鼠海马CA3区JNK蛋白阳性表达量比较（s）

表2 各组大鼠海马CA3区JNK蛋白阳性表达量比较（s）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与石杉碱甲组比较，③P＜0.05

组 别 JNK蛋白阳性表达量假手术组 0.433±0.127模型组 2.307±1.359①石杉碱甲组 0.808±0.312②中药低剂量组 1.559±0.942②③中药中剂量组 1.403±0.591②③中药高剂量组 1.108±0.367②n 剂量（g/kg）20 —20 —20 0.003 20 4.15 20 8.30 20 16.90

表2显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马CA3区 JNK 蛋白阳性表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组大鼠海马CA3区JNK蛋白阳性表达量均有显著下降（P＜0.01）；各用药组中石杉碱甲组JNK蛋白阳性表达量降低效果最为明显，优于中药中、低剂量组（P＜0.05），而与中药高剂量组差异无显著性意义（P＞0.05）。

4 讨论

老年性痴呆以学习记忆障碍为最重要的临床症状，改善学习记忆能力成为当今神经科研究的热点之一。行为学检测是判断老年性痴呆的基本方法，Morris水迷宫作为研究神经系统病症最常用的工具之一，在行为学检测中具有十分重要的意义，尤其在啮齿类动物神经认知疾病模型的研究中广泛使用，已成为研究啮齿类动物行为学的经典实验方法［6］，故本课题采用此方法检测大鼠的学习记忆能力。

现代研究发现，神经递质及其信号传递通路在学习、记忆中起着关键的作用，特别是NF-κB信号通路在突触可塑性中发挥极其重要的作用［7］。NF-κB信号通路主要通过自由基、氧化应激及神经炎症途径参与了AD的病理生理过程。JNK作为一类调节蛋白，在中枢神经系统和周边神经系统中发挥重要作用。JNK等基因在其他旁路途径对NF-κB的活化同样起着至关重要的作用［8］。研究表明，引起神经细胞凋亡包括老年性痴呆在内的退行性变的主要原因是NF-κB活化受到抑制［9］，神经细胞遭遇外界凋亡刺激时激活了JNK，JNK介导神经细胞的凋亡过程［10］。因此，本研究通过诱导老年性痴呆大鼠模型，在早期及时进行用药干预，观察各组大鼠海马CA3区JNK蛋白的表达变化情况，以探讨温脾通络开窍汤对改善老年性痴呆大鼠学习记忆能力的作用机制。

老年性痴呆属中医学“中风”“痴呆”范畴。清代陈士铎在《辨证录·呆病门》中论及痴呆的治疗方法中谈到“治呆无奇法，治痰即治呆”［11］。本课题组亦认为痰浊瘀血阻窍乃是老年性痴呆的关键病机，倡导“温脾通络开窍”之法，在AD早期用温脾通络开窍汤进行干预治疗，防止疾病发展。方中黄芪为主药，功专补气升阳，其中黄芪甲苷能抑制海马神经元的凋亡［12］；益智仁取其温肾阳以助脾阳之意，具有抗癌、抗氧化等作用，能够改善记忆障碍［13］；三七通络活血，其中三七总皂苷能减轻AD的病理损害［14］；石菖蒲豁痰开窍醒神，能提高脑内SOD酶活性，降低MDA的水平［15］；何首乌补益肝肾，具有改善学习记忆的作用［16］；绞股蓝温脾化痰，具有保护神经功能、抗氧化的作用［17］。诸药相合，温脾以治本，通络祛痰以除标，达到开窍醒神之效［18］。

前期研究已证实，温脾通络开窍汤可明显改善AD大鼠学习及记忆功能［19］。本课题通过AD大鼠模型，观察大鼠跨越平台的平均次数及药物对海马CA3区神经元JNK蛋白表达的影响。结果表明，中药组及石杉碱甲组大鼠跨越平台的次数明显增加，优于模型组；随着药物浓度的增高，中药组大鼠的学习记忆能力改善越明显（P＜0.05 或 P＜0.01），中药高剂量组跨越平台的次数与石杉碱甲组跨越平台的次数相当。根据JNK蛋白表达量可知，与模型组相比，用药组表达均有一定程度的下降，其中石杉碱甲组降低效果最为明显，中药高剂量组和石杉碱甲组效果相当。随着药物浓度的增高，中药组降低JNK蛋白表达量效果越好（P＜0.01）。由上可知，温脾通络开窍汤能够改善AD大鼠的学习记忆能力，可能与其下调海马CA3区JNK的蛋白表达量，进而减轻神经细胞凋亡过程相关，具体机制还有待进一步探讨。