黑木耳单孢杂交菌株选育研究初报

李红，刘国丽，刘岩岩，张敏

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161）

黑木耳（Auricularia auricula-judae（bull.）Quel.）隶属于担子菌门（Basidiomycota），伞菌亚纲（Agaricomycetes），木耳目（Auriculariales），木耳科（Auriculariaceae），木耳属（Auricularia），具有非常重要的食药用价值。中国是世界上黑木耳生产大国[1]，辽宁省是仅次于黑龙江省和吉林省的黑木耳生产大省，种植总量已接近1亿袋，干品年产量5 300 t，产值近3亿元，在农业产业结构调整和农民增收方面发挥了重要作用。近年来由于菌种选育工作滞后，黑木耳杂交种较少，绝大多数是由野生种驯化而来，且缺乏不同季节、不同栽培方式、不同地区的生产专用型品种，严重影响该产业发展，因此对黑木耳高产优质菌株的筛选和选育工作势在必行[2]。该试验选取黑木耳2个主栽品种为亲本，采用单孢杂交方式，使两亲本优势互补，旨在筛选出适合辽宁地区气候条件下高产、优质、抗性强的优良黑木耳新品种，为黑木耳产业的健康发展提供保证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 杂交亲本。黑29和黑山菌株均为辽宁省农业科学院食用菌研究所的保存菌种（表1）。

1.1.2 培养基。①PDA综合培养基配方，土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，蛋白胨0.3%，水1 000 mL，pH自然。用于单孢子分离、单孢子培养、单核菌丝配对等室内试验；②栽培基质配方，木屑85.5%、麸皮10%、豆饼粉2%、石膏1%、石灰1.2%、磷酸二氢钾0.3%，含水量60%，用于制作二级种及出菇试验。

表1 亲本特征特性

1.2 方法

1.2.1 单孢子收集与分离。选七八分熟、耳型好、无病虫害的亲本子实体，去根，表面用75%酒精消毒。在超净工作台下，分别挂于灭过菌的三角瓶中，用灭过菌的牛皮纸封口，静置培养15～17 h，用无菌水稀释，即成孢子液原液，放置4℃冰箱中保存待用。在无菌的条件下，用10 mL的注射器在超净工作台上将孢子原液分别稀释成10-1、10-2、10-3等浓度，在显微镜下观察每滴孢子液中所含孢子的数量，当每滴孢子液中含有2～3个孢子时为最佳接种液，用移液枪吸取最佳接种液0.5 mL，均匀涂于平板PDA培养基中，在23℃恒温箱中倒置避光培养8～10 d，待孢子萌发[4]。

1.2.2 单核菌丝检查。新菌落萌发至直径为2～3 cm时，镜检单孢子萌发的菌丝，观察有无锁状联合。将无锁状联合的单核菌丝转接到斜面PDA培养基上，23℃下培养，待菌丝长满培养基后置于4℃备用。

1.2.3 单孢杂交。黑29菌株和黑山菌株的单核菌丝接种在同一平板PDA培养基上，接种点相距3 cm，23℃下培养8～12 d，镜检单核菌丝结合处，如发现锁状联合，说明杂交配对成功。

1.2.4 杂交菌株鉴定。①拮抗试验，采用三点接种法，分别把亲本菌株及杂交菌株接种在平板PDA培养基上，每两点间距2 cm，接种后在23℃下恒温箱培养，观察杂交菌株与亲本之间有无拮抗线；②酯酶同工酶电泳试验，取亲本及杂交菌株菌丝体，加入酶提取液在冰浴中研磨后，离心取上清液备用，采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，将电泳后的凝胶浸入染色液中，观察杂交菌株与亲本菌株的酯酶同工酶电泳图谱。

1.2.5 菌丝生长速度测定。将各杂交菌株和亲本菌株接种在平板PDA培养基上，23℃下黑暗培养，观察菌丝生长势及色泽。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速度。

菌丝生长速度＝培养皿直径/培养总时间。

1.2.6 栽培对比试验。采用17 cm×35 cm×0.04 cm聚丙烯塑料袋，根据栽培基质配方，每袋装干料250 g，杂交菌株和亲本菌株各接种300袋，按露地全光标准栽培模式管理，定时扎眼、催芽，观察记录菌丝长势、污染袋数、出芽到耳片分化的时间、子实体生长状况等。

2 结果与分析

2.1 单孢收集与分离

将黑29和黑山2个亲本菌株进行孢子收集、稀释分离及培养，镜检鉴定亲本菌株黑29的孢子单核体35个，黑山的孢子单核体20个，单核体菌丝与双核菌丝相比，菌丝纤细，不具有锁状联合（图1），菌落较疏松（图2），不一致，不均匀，绒毛状，菌丝生长速度一般比双核菌丝长速慢。

2.2 杂交菌株配对

从亲本单核体材料中各随机挑取10个单核体材料进行两两配对杂交，挑取两菌落交接处菌丝体进行镜检，双核菌丝（图3）且无成功配对的（图4）有锁状联合的30个菌株初步确定为杂交菌株（图5）。

2.3 杂交菌株鉴定

2.3.1 拮抗试验。将配对成功的30个杂交菌株与两亲本进行拮抗试验，结果表明，有17个杂交菌株与亲本存在明显的拮抗反应（图6），将这些杂交菌株依次编号为D1～D17，转管备用。

图1 单核体菌丝

图2 单核体菌落

图3 双核体菌丝（×400）

图4 未成功配对

图5 成功配对

图6 部分杂交菌株与亲本菌株的拮抗反应

图7 杂交菌株与亲本菌株间酯酶同工酶酶谱

2.3.2 酯酶同工酶电泳试验。从图7可以看出，19个菌株共检测 101条谱带，得到11个酶谱类型，Rf 0.196～0.761，其中 Rf2=0.359、Rf7=0.587、Rf9=0.652为所有菌株共有的3条基础酶带，但酶带宽窄、浓淡略有不同。D1与亲本1，D6、D9、D10与亲本2谱带基本相同，但是其他杂交菌株与2个亲本都有很大差异，Rf1、Rf4、Rf6、Rf8、Rf10均为杂交菌株的特异性酶带。说明杂交菌株既与亲本之间有同源性，又有属于自己的特征酶带，是有别于亲本的新菌株。在凝胶的某个相同的迁移率位置上有条带的记为1，无条带的记为0，利用DPS数值处理系统软件中的UPGMA计算19个黑木耳菌株酶谱之间的联合系数，并对所得的酶带进行系统聚类分析。从图8可以看出，在相异水平60%左右时，可以把19个菌株分为5类，第一类包括亲本 1、亲本 2、D1、D2、D5、D6、D9、D10、D12、D13、D14、D15、D17 等 13 个菌株；第二类包括D7 1个菌株；第三类包括D3、D8 2个菌株；第四类包括D11、D16 2个菌株；第五类包括D4 1个菌株。

图8 聚类分析图

2.4 菌丝生长速度测定

从表2可以看出，杂交菌株经鉴定，选择具有拮抗并且遗传差异与亲本较大的11个杂交菌株进行菌丝生长速度测定。杂交菌株 D4、D8、D11、D12、D14菌落颜色浓白，边缘整齐或较整齐，菌丝生长速度大于亲本2，可以初步判定为优良菌株，进行下一步出菇试验。其他杂交菌株菌落颜色灰白，边缘不整齐，菌丝生长速度慢，小于亲本菌株，应予淘汰。

2.5 栽培对比试验

栽培性状是鉴别食用菌品种优劣的重要标准之一，对不同黑木耳品种进行栽培对比试验，是筛选最优品种的有效方法。栽培对比试验结果见表3，杂交菌株D4、D12、D14子实体形体与亲本1相似，D4现耳时间早，出耳整齐度一般，抗性一般，产量最高，但是没有超过亲本1，D12和D14现耳时间较早，出耳整齐度低，抗性较差，产量低；杂交菌株D8、D11子实体形态与亲本2相似，D8与D11比较来看，现耳时间较早，出耳整齐度高，抗性强，产量超过亲本2，达到40 g/袋，D11则次之。单从产量上看，D4高于D8，但是从子实体形态上看，少筋品种比多筋商品性强，价钱高，所以D8比D4较有优势，可作为一个优良的杂交菌株进行储备，具有开发成为新品种的潜力（图 9）。

表2 菌丝生长速度及生长势

表3 不同黑木耳菌株子实体生长情况及产量

图9黑木耳不同杂交菌株的子实体形态

3 结论与讨论

单孢杂交是利用子实体里的单孢，将不同基因、远源的亲本互相交配，把产生了锁状联合的双核体单独的进行生产试验和产量的验证，从中可以找到所需的优良配对组合。单孢杂交是食用菌育种工作中最常用的方法，杂交过程随机性强，工作量较大但效率不一定高，杂交菌株的优劣必须通过栽培试验才能确定[5-6]。多次试验证明虽然单孢杂交育种效率不高，但具有选育优良杂交菌株的潜力，不过需要育种工作者大量的杂交筛选工作及多年栽培试验。

杂交菌株的鉴定是黑木耳杂交育种的重要工作。该试验从以下几个方面对黑木耳杂交菌株进行规范性鉴别：一是观察杂交菌株是否存在锁状联合；二是进行与亲本间是否存在拮抗现象的试验；三是进行酯酶同工酶试验，观察杂种与亲本的亲缘关系；四是进行出菇试验，观察杂种能否结实及子实体的生长状况。这些鉴别指标是目前食用菌育种专家的共识[7-8]。杂交菌株D8商品性强，产量比亲本有明显优势，但是尚需进行连续跟踪试验，确定其丰产性和稳定性，摸清其配套的栽培技术和菌株生物学特性，并申请国家新品种审（认）定。