高寒地区垂穗披碱草种质对低温胁迫的生理响应及其耐寒性评价

梁坤伦,贾存智,孙金豪,王明艳,傅华,毛祝新

(1.黄河科技学院, 河南 郑州 450063；2.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；3.陕西省西安植物园, 陕西省植物研究所, 陕西 西安 710061)

青藏高原地域辽阔，环境气候独特，植物资源丰富，是我国重要的畜牧业生产基地[1]。多年来，由于气候变化和超载放牧等原因，天然草地不断退化，草地沙化和水土流失问题突出[2]。高寒草地生态修复是解决上述问题的关键，包括对退化草地进行改良和建设优质草场[3]。但是，高寒地区种植的牧草必须具备较强的耐寒性[4]。前人研究发现，高原地区乡土草更适宜高寒草地建植[4-5]。这是因为该类植物在漫长的进化过程中，充分适应低温环境。所以，收集和筛选高寒草原野生牧草种质，可促进人工草地建设，有利于青藏高原草地生态修复。

垂穗披碱草(Elymusnutans)是禾本科(Gramineae)披碱草属(Elymus)多年生草本植物，分布海拔范围2500～4000 m，是青藏高原地区的重要牧草[5]。垂穗披碱草在高寒地区广泛分布，是由于其在长期的适应性演化过程中形成一套完善的抗氧化防御系统，能够有效抵御低温对其生理特性的损伤[4-5]。在低温胁迫下，植物细胞内活性氧过量积累，细胞膜透性增加，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)作为植物细胞中第一道抗氧化防线，能够将超氧阴离子自由基转换为H2O2，过氧化物酶(peroxidase, POD)能够将H2O2进一步分解，消除由于活性氧积累对细胞的毒害作用[6]。在低温胁迫下，垂穗披碱草的SOD和POD活性增强[7]；游离脯氨酸和可溶性糖含量增加[8]。研究人员发现垂穗披碱草耐寒性与种质有关，付娟娟等[4]研究发现，西藏当雄地区的垂穗披碱草耐寒性优于甘肃甘南州种质。张尚雄等[8]研究表明，西藏不同地区披碱草属植物的耐寒性也存在较大差异，青县野生垂穗披碱草>同德老芒麦(Elymussibiricus)>那曲县野生垂穗披碱草。这说明垂穗披碱草的耐寒性受遗传控制，不同种质之间存在差异。本研究从青藏高原收集10种野生垂穗披碱，通过低温模拟试验，探讨不同低温胁迫时间对生理代谢的影响。根据种质低温生理应答，筛选耐寒性强的种质材料，以期为高寒草地生态修复提供优良种质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料于2012年采收自青海省、甘肃省和四川省高寒草地。本试验选取10份种质进行耐寒性生理研究。种源地地理坐标和种质生境见表1。

1.2 试验设计

选取成熟饱满种子，经0.1%(W/V)次氯酸钠溶液消毒，用蒸馏水冲洗，均匀置于铺有湿润滤纸的培养皿中，然后将培养皿置于人工气候箱(光通量密度350 μmol·m-2·s-1，光期14 h，25 ℃，湿度70%；暗期10 h，20 ℃，湿度60%)中萌发。萌发后7 d进行移栽，将长势一致的幼苗转移至育苗盘中，每盘40苗，采用沙培的方式在人工气候箱中继续进行幼苗培养，期间幼苗每5 d浇1次Hoagland营养液。28 d后开始进行低温胁迫处理，每个处理3个生物学重复。处理前，材料先放进15 ℃培养箱中预冷24 h，之后按照2.5 ℃·h-1的速度降至4 ℃，以25 ℃生长材料为对照(CK)，开始低温胁迫8、24和72 h。各时间节点，剪取不同叶位叶片并混合，样品称重后锡纸包裹，经液氮速冻后放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

表1 垂穗披碱草种源地坐标和气象数据 Table 1 The source and meteorological data of 10 germplasms of E. nutans

注：下文图表中出现的材料名称均以此表中编号表示。

Note:The codes of material names will be used in following Figures and Tables.

1.3 测定指标

采用电导法测定细胞膜透性[9]，以叶片电导率表示；采用分光光度法测定叶绿素含量[9]；采用茚三酮法测定游离脯氨酸(free proline, Pro)含量[9]；可溶性糖(soluble sugar, SS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性含量参照《植物生理学实验教程》[10]测定。

1.4 参试材料苗期耐寒性综合评价

1.4.1耐寒性评价方法 参试材料的耐寒性评价采用隶属函数法[11]，各指标的隶属函数值：

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中:Xj表示第j个指标值，Xmin表示第j个指标的最小值，Xmax表示第j个指标的最大值，如某一指标与耐寒性呈负相关，可用反隶属函数计算其耐寒隶属函数值，即μ(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)。

式中：Wj表示第j个指标的权重。

式中：D表示各材料耐寒性综合评价值，D值越大表明耐寒性越强。

1.4.2耐寒性评价分级标准 参试材料耐寒性D值可以分为3级[8]。Ⅰ级：综合评价值0.7以上，为耐寒性强；Ⅱ级：综合评价值为0.5～0.7，为耐寒性中等；Ⅲ级：综合评价值在0.5以下，为耐寒性弱。

1.5 数据处理

应用SPSS 16.0进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 垂穗披碱草对低温胁迫的生理响应

2.1.1低温对叶片膜透性的影响 植物遭受低温冷害时，膜脂发生相变，膜透性增加，溶质向胞外渗透。所以，细胞质膜相对透性可反映低温下细胞膜受伤害的程度。从图1可以看出，低温胁迫下参试材料叶片相对膜透性增加，增幅最大的是种质ZQ、REG、LQ、LT、GC和AB。不同低温胁迫时间对相对膜透性的影响不同，种质REG和AB细胞膜受损最严重，低温胁迫8 h时叶片膜透性显著增加318%和143%，但在24和72 h处理间无显著差异。种质ZQ、LQ、LT和GC在8 h时比对照显著增加61%、42%、23%和108%，在低温胁迫24 h时膜透性达到最大，胁迫72 h时趋于稳定，分别恢复了5%、2%、15%和2%。在8 h低温处理下，材料MQ、XH、ZN和HZ叶片相对膜透性增加，经24和72 h低温胁迫，叶片膜透性显著高于对照。参试材料中，MQ、XH和HZ膜透性相对较小，低温胁迫72 h时相对膜透性较24 h时分别降低18%、43%和38%，表明这3种材料叶片细胞膜受损较小，对低温胁迫的耐受性更强。

图1 低温对垂穗披碱草叶片相对膜透性的影响Fig.1 Effect of low temperature on relative membrane permeability of E. nutans 不同小写字母表示同一材料在不同处理间差异显著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters indicate significant difference within the same material among different treatments (P<0.05), the same below.

2.1.2低温对叶绿素含量的影响 低温胁迫下，叶绿素的合成速率受到抑制。本试验中，低温胁迫下垂穗披碱草叶绿素含量先降低后增加(图2)。在8 h处理下，种质材料叶绿素含量均降低，种质ZQ和LQ叶绿素含量降幅最小，仅为3%和4%，其他种质叶绿素含量显著降低。种质XH、ZN和GC降幅最大，分别降低17%、18%和21%。在24 h时，叶绿素含量继续降低，不同种质降幅不同。其中，ZQ降幅最小，低于对照9%，ZN、REG和GC降幅最大，分别降低41%、36%和37%。在72 h时，各种质材料叶绿素含量不同程度增加，增幅最大的是ZN和GC，分别比24 h时增加39%和40%。材料ZQ、XH和LQ分别比24 h时增加2%、2%和3%。本试验中，低温处理24 h时，叶片叶绿素含量最低；低温处理72 h时，叶片叶绿素含量较24 h有所增加，其中种质ZQ、XH和LQ叶绿素含量与CK无显著性差异，其他种质含量显著低于CK(P<0.05)。

图2 低温对垂穗披碱草叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of low temperature on chlorophyll content of E. nutans

2.1.3低温对游离脯氨酸含量的影响 低温胁迫下不同种质叶片脯氨酸含量逐渐增加(图3)。在低温胁迫8 h时，种质XH、LQ和AB游离脯氨酸含量增加最多，分别比对照增加58%、59%和90%，种质GC增幅最小，仅为11%；在低温胁迫24 h时，种质ZQ、LQ和AB游离脯氨酸增幅最大，分别比对照增加83%、84%和94%，种质GC增幅最小，仅为44%。在低温胁迫72 h时，参试材料的游离脯氨酸含量继续增加，均显著高于CK(P<0.05)，增幅为87%～99%。需要指出的是，在低温胁迫下，除种质GC外，其他种质游离脯氨酸含量均显著高于对照(P<0.05)。

图3 低温对垂穗披碱草游离脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of low temperature on free proline content of E. nutans

2.1.4低温对可溶性糖含量的影响 垂穗披碱草可溶性糖在低温胁迫下逐渐增加(图4)。在低温处理8 h时，种质MQ、ZN、REG、LQ和AB可溶性糖含量显著增加，其中种质ZN可溶性糖含量增幅最大(128%)。但是该处理下种质ZQ比CK降低12%；低温处理24 h时，种质ZN和LT可溶性糖含量增加最多，比CK显著增加100%和104%，种质GC增幅最小，比CK含量增加14%；低温处理72 h时，种质ZN可溶性糖含量比24 h处理显著增加54%，比CK增加208%。种质XH可溶性糖含量比24 h处理降低24%，但是比CK显著增加12%。本试验中，不同低温胁迫时间内种质ZN和LT可溶性糖含量增幅最大，种质ZQ、MQ和HZ较为稳定，这说明ZN和LT耐寒性相对较强，ZQ、MQ和HZ耐寒性较为稳定，且能经受72 h的低温胁迫，说明上述种质能够耐受较长时间的低温胁迫，其低温耐受性可以用可溶性糖含量评估。

2.1.5低温对酶活性的影响 垂穗披碱草叶片SOD和POD活性在低温胁迫下先增加后降低，但不同种质变化幅度不同。低温胁迫8 h时，种质MQ的SOD活性显著增加(P<0.05)，比CK增加109%，种质REG和GC增幅最小，分别比CK增加5.0%和0.2%；低温处理24 h时，种质MQ和LT的SOD活性增幅最大，分别比CK增加147%和148%。但种质GC和AB的SOD活性增幅较小，分别比CK增加18%和22%；低温处理72 h时，种质ZQ和LT的SOD活性分别比CK增加57%和43%，种质ZN和REG的SOD活性分别比CK降低49%和24%。本试验中，低温处理24 h时，叶片SOD活性最高；低温处理72 h时，种质ZQ和LT叶片SOD活性显著高于CK(P<0.05)，种质ZN和REG显著低于对照(P<0.05)，其他种质SOD活性与CK无显著差异。

图5 低温对垂穗披碱草SOD活性的影响Fig.5 Effect of low temperature on SOD activity of E. nutans

图6 低温对垂穗披碱草POD活性的影响Fig.6 Effect of low temperature on POD activity of of E. nutans

低温胁迫下，垂穗披碱草叶片POD和SOD活性的变化趋势基本一致，但不同种质的POD活性变化存在差异(图6)。低温处理8 h时，种质GC和AB的POD增幅最大，显著增加251%和221%，种质HZ增幅最小，仅增加13%。低温处理24 h时，种质GC的POD活性继续增加，较CK增加257%，种质HZ增幅最小，较CK增加49%。低温处理72 h时，种质GC的POD活性显著增加(P<0.05)，较CK增加220%。种质MQ和AB比CK低3%和30%。本试验中，低温处理8 h时，各种质叶片POD活性均显著高于CK；低温处理24 h时，除种质AB外，其他种质POD活性均达到最高。低温处理72 h时，叶片POD活性降低，但种质ZQ、HZ、LQ、LT和GC显著高于CK。

2.2 种质耐寒性综合评价

为减少不同处理结果在耐寒性评价中存在的相互覆盖，参照各指标相对值变异系数[8,12]，本试验选取低温胁迫24 h的指标变化率评价其耐寒性。先通过主成分分析判断各成分的贡献率，再计算抗寒隶属函数值。主成分分析结果显示，3个主成分的贡献率依次为40%、29%和22%，累计贡献率达到91%。其中第1主成分(F1)主要包括SOD和POD，第2主成分(F2)主要包括相对膜透性和可溶性糖，第3主成分(F3)主要包括叶绿素和游离脯氨酸(表2)。

表2 各综合指标系数及贡献率 Table 2 The coefficient and contribution rate of every comprehensive index

采用标准差系数赋予权重法对10份垂穗披碱草种质进行耐寒性评价(表3)。评分越高，种质耐寒性越强。10份材料综合评价值介于0.12～0.82；根据植物耐寒能力分级标准，种质LQ、ZN和AB综合评价值>0.7，耐寒性最强；种质REG综合评价值为0.53，耐寒性中等；种质LT、GC、XH、ZQ、HZ和MQ综合评价值<0.5，耐寒性弱。

表3 各综合指标得分、隶属函数值和耐寒性综合评分 Table 3 Comprehensive index score, subordinate function value and cold resistance comprehensive score of different germplasms

3 讨论

3.1 叶片膜透性与垂穗披碱草耐寒性的关系

叶片膜透性是评价植物耐寒性的重要生理指标。低温胁迫下，质膜的结构和功能受到伤害，导致细胞膜透性增大，电解质外渗，电导率增大，该指标能够客观反映植物在低温逆境中的伤害状况[13]。耐寒性不同的品种，膜结构的稳定性不同，可用低温胁迫下相对膜透性的增大程度，评价植物耐寒性的强弱[14]。前人研究发现，耐寒性强的植物受冻害较轻，相对膜透性增加较少，膜伤害程度较轻，后期可恢复正常；耐寒性弱的植物则受害程度重，膜透性显著增大且难以恢复正常[15-16]。本研究发现，低温胁迫下垂穗披碱草叶片相对膜透性逐渐增加。在低温处理8 h时，各材料叶片相对膜透性增幅较小，受到的冷害较轻。随低温胁迫时间的延长，叶片膜透性增至最大，各材料受到明显冷害。整个低温胁迫过程中，种质REG和AB叶片细胞膜受到严重伤害，相对膜透性显著增加。种质LT叶片相对膜透性增加最少，表明其叶片细胞膜受到的伤害较弱，材料XH和HZ在低温胁迫后期相对膜透性降低，说明夏河和合作地区种质对低温胁迫耐受性更强。

3.2 叶绿素与垂穗披碱草耐寒性的关系

叶绿素是植物光合作用中吸收光能的主色素，在植物体内处于不断合成与分解的动态平衡，其含量受多种因素影响[17]。低温胁迫下植物叶绿素含量降低，光合酶活性减弱，光合速率降低[18]。植物叶片叶绿素含量增加，有利于光合作用顺利进行，增加有机物积累，降低渗透势，增强细胞保水力，提高植物耐寒性[19]。刘国君等[20]发现常绿植物叶绿素含量，从10月到次年1月逐步下降，次年1月达最低点，次年1月到3月又大幅度回升。何云等[13]研究发现，低温环境下丛毛羊胡子草(Eriopnrumcomosuny)和金发草(Pogonatherumpaniceam)叶绿素含量降低，12月的叶绿素含量显著低于8月，这说明植物的叶绿素含量随温度降低而减少，在温度最低的时间叶绿素含量也最低。本研究中，低温对种质ZN和GC的叶绿素含量影响显著，但是该材料光合系统修复能力较强，在适应低温环境后，叶绿素含量迅速增加。低温胁迫下，种质ZQ和LQ光合系统稳定性较强，叶绿素含量在低温胁迫初期降低，在适应低温环境之后，含量稳定或有所增加。整体来看，叶绿素含量在低温下先减少后增加，可能是因为低温初期，植物叶片通过激素调节，部分叶绿素降解，光合速率降低。在植物光合系统逐渐适应低温后，叶绿素含量有所恢复[21]。综合评价结果显示，叶绿素含量稳定的种质ZQ耐寒性不强，这说明，耐寒性除了与叶绿素含量有关外，还与种质特性有关。

3.3 可溶性糖和游离脯氨酸与垂穗披碱草耐寒性的关系

可溶性糖和游离脯氨酸是植物重要的营养物质和渗透调节物质[22]。可溶性糖含量增加能提高细胞渗透液浓度，调节组织渗透势，提高保水能力，保护细胞不致遇冷凝固，从而提高植物耐寒性[13,15]。杜永吉等[15]研究发现，可溶性糖与结缕草(Zoysiajaponica)耐寒性密切相关，低温下结缕草可溶性糖逐渐增加，耐寒性强的品种可溶性糖含量更高。张尚雄等[8]也发现，耐寒性强的披碱草可溶性糖含量高，可溶性糖在低温环境显著增加；刘慧民等[23]在地锦属植物中研究发现，低温时可溶性糖增加，并在冬季最冷时期含量最高。本研究中，低温胁迫下垂穗披碱草可溶性糖含量逐渐增加，但在不同品种和不同处理间存在差异。低温胁迫下种质ZN和LT可溶性糖含量增加最多，但是综合评价结果显示，这两者不是耐寒性最强的种质，这说明植物体内的可溶性糖含量高低不仅与低温耐受程度有关，还与种质本身的特性有关。

植物叶片游离脯氨酸在低温环境下逐渐增加，脯氨酸的积累是植物在低温环境中的应激保护，脯氨酸能有效清除自由基，稳定植物细胞膜[24-30]。但是，关于脯氨酸在植物耐寒性中的作用一直存在不同的观点。如韩发等[7]在垂穗披碱草中研究发现，高浓度脯氨酸是植物耐寒的重要原因，但Hekneby等[31]和王世珍等[32]却提出低温环境下植物脯氨酸增加可能与其耐寒性无关。也有研究认为，植物游离脯氨酸增加程度与植物的抗逆性呈负相关[14,28]。当前关于脯氨酸与植物耐寒性相关研究中，学者们尚未得到绝对一致的结论，这说明植物脯氨酸与耐寒性的关系可能因植物而异[24-25]。而在本研究中，低温胁迫下游离脯氨酸逐渐增加，这与王世珍等[32]在高羊茅(Festucaarundinacea)中研究结果相似。本试验还发现，长时间低温胁迫下，植物叶片游离脯氨酸显著增加，这说明垂穗披碱草脯氨酸在低温环境下累积效应明显，脯氨酸可作为垂穗披碱草耐寒评价的重要参考指标。

3.4 超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性与垂穗披碱草耐寒性的关系

SOD和POD是植物酶促防御系统中的重要保护酶，逆境中维持较高的酶活性，可以消除细胞内活性氧对细胞膜的伤害，减少膜质过氧化，稳定膜透性[14]。SOD主要作用是清除超氧自由基，同时产生歧化产物H2O2。POD具有酶促降解H2O2作用，减轻有害物质对细胞的伤害，表现出一定的抗逆性[28]。两者在低温胁迫下的变化趋势相似。本研究中，垂穗披碱草在低温胁迫下叶片SOD和POD活性增强。这说明SOD和POD作为植物细胞保护酶，酶活性与植物耐寒性有关[3,12]。前人研究表明[23,30]，在低温胁迫下，耐寒性强的植物SOD和POD能维持较高的酶活性水平，减少活性氧自由基的积累，减轻膜伤害，增加植物体耐寒性。马智宏等[33]研究发现，耐寒性强的草坪草在低温环境能保持较高的SOD和POD活性，有利于适应低温环境。本研究中，种质ZQ和LT的SOD和POD酶活性在低温胁迫下显著增加，但是随胁迫时间的延长，酶活性有所降低，但仍维持较高水平，使得垂穗披碱草能够耐受较长时间的低温胁迫。低温环境下植物叶片SOD和POD维持较高的酶活性，能够保持植物细胞中活性氧代谢的动态平衡，减少氧化自由基累积，减弱膜脂过氧化作用，减轻细胞膜的破坏程度。从这个角度分析，本研究中种质ZQ和LT对低温环境适应性更强。

3.5 垂穗披碱草耐寒性综合评价

植物耐寒性是一个受多因素影响的数量性状，单一指标难以全面准确反映耐寒性强弱，可结合多指标综合评价植物耐寒性[12-13]。隶属函数评价法是一种有效的综合评价法，已在披碱草[8]、早熟禾(Poapratensis)[12]和菌草[34]耐寒性评价中得到应用。本研究应用该方法发现，垂穗披碱草种质ZN、LQ和AB耐寒性最强，REG耐寒性最弱。本研究对高寒地区种质耐寒性评价具有参考价值，得到3种耐寒种质对垂穗披碱草育种和耐寒机制研究具有重要意义。