不同草田轮作方式对土壤肥力、微生物数量及自毒物质含量的影响

尹国丽，蔡卓山，陶茸，吴芳，陈建纲，师尚礼

(甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有优良的饲用价值和固氮、保持水土、改良土壤结构等多重生态功能，在世界五大洲广泛种植，素有“牧草之王”的美称[1]，随着农业可持续发展战略和粮改饲工程的实施，紫花苜蓿的重要性日益凸显。但是，作为多年生牧草，紫花苜蓿连作一定年限后会产生连作障碍，成为限制紫花苜蓿种植的一个瓶颈问题。研究证实，连作障碍的发生不仅与土壤理化性质的改变有关，还与土壤微生物的组成有关[2]，土壤微生物作为土壤中的活性因子，是反应土壤质量最敏感的指标之一，近年来已有大量的研究表明土壤微生物与连作障碍之间存在密切关系[3-5]。除此而外，作物的自毒作用也是引起连作障碍一个不容忽视的方面[6]。紫花苜蓿种子中含有水溶性自毒物质[7]，植株分泌自毒物质，经过多年连续种植后的累积，会产生自毒现象，导致土壤养分过度积累或消耗、自毒物质积累、苜蓿产量品质下降等。

草田轮作是农业生产中消减连作障碍普遍采用的措施之一，试验证明轮作不仅可以调节不同作物之间对养分吸收的差异，避免养分失衡，提高土壤养分的有效性和酶活性，还可以通过根系分泌物的变化，调节根际微生物群落的组成，减少土传病虫害的发生，同时利用不同作物对自毒物质的反应不同，可减轻自毒危害，提高经济效益[8]。王劲松等[9]研究发现，对高粱(Sorghumbicolor)连作3年地轮作苜蓿和葱(Alliumfistulosum)，可以提高土壤微生物活性和酶活性，控制高粱的连作障碍，增加高粱产量。秦舒浩等[10]研究得出合理轮作天蓝苜蓿(Medicagolupulina)、陇东苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)3种豆科植物，对马铃薯(Solanumtuberosum)连作农田土壤速效氮、速效磷及速效钾含量均有不同程度的促进作用。

科学合理的轮作模式可以有效缓解连作障碍引起的土壤环境恶化，使土壤中微生物活性增强、多样性增加，为后续作物生长提供健康稳定的土壤生态环境[11]。目前关于紫花苜蓿草田轮作的研究报道相对较多，但前人的研究多集中在轮作对农田土壤肥力及产量的影响方面，缺乏紫花苜蓿-作物轮作系统中土壤自毒物质含量方面的研究报道[12]。鉴于此，本试验以5龄紫花苜蓿草地为研究材料，分析在不同轮作模式下土壤自毒物质含量、土壤肥力及土壤微生物的动态变化及其相互关系，旨在探索紫花苜蓿连作障碍的形成机制，为采用轮作措施消减紫花苜蓿连作土壤自毒效应提供科学依据，并为半干旱地区草田轮作和草地生态农业的可持续发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在甘肃省武威市凉州区甘肃农业大学黄羊镇牧草实验站开展。该地区位于甘肃河西走廊东端(E 103°5′，N 37°30′)，属冷温带干旱区，是典型的大陆性气候，日照充足，春季多风沙，夏季有干热风。平均海拔1776 m，降水年际变化不大，但季节变化较大，多年平均降水量160 mm，主要集中在7、8、9三个月，冬春季干旱，降水无法满足作物生长的需要。年蒸发量2400 mm，年平均气温7.2 ℃，1月最低气温 -27.7 ℃，7月最高气温34.0 ℃，≥0 ℃年积温3513.4 ℃，≥10 ℃年积温2985.4 ℃。全年无霜期156 d，绝对无霜期118 d，年日照时数2945 h。土壤以荒漠灌淤土为主，粉沙壤质，土层深厚。

1.2 供试材料

供试材料小麦(Triticumaestivum)品种为杂交种春宁4号，玉米(Zeamays)品种为杂交种陇单4号，紫花苜蓿品种为甘农3号。小麦及玉米种子市售，紫花苜蓿种子由甘肃农业大学草业学院提供。

1.3 试验设计

试验地位于甘肃省武威市黄羊镇甘肃农业大学牧草实验站。选取地势平坦的紫花苜蓿草地进行草田轮作试验。设计如表1所示5个处理。试验小区面积为4 m×5 m，不同小区间设1 m隔离带，每个处理3个重复，不同小区的土壤肥力状况及管理方式相同。

1.4 土样采集

于2017年7月中旬采集土壤样品，处理按照“5点取样法”，用土钻分别取0～30 cm土层土样，将所得土壤样品装入无菌塑料袋，做好标签。除去杂质，均匀混合后，过1 mm筛，分为3份，一份带回实验室立即测定土壤酚酸类自毒物质和香豆素的含量，一份用于测定土壤肥力，一份土壤-4 ℃保存，用于测定土壤微生物。

表1 紫花苜蓿-玉米/小麦不同轮作处理 Table 1 The different treatments of alfalfa-crop/wheat rotation

1.5 试验方法

1.5.1土壤化学性质测定 采用重铬酸钾法测定土壤有机质含量；采用凯氏定氮法测定土壤全氮含量；采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量；采用火焰光度法测定全钾含量；先用醋酸铵浸提，再用火焰光度法测定土壤有效钾含量；采用HClO4-H2SO4消煮法测定全磷含量；采用碳酸氢钠浸提-铝锑抗比色法测定有效磷含量[13]。

1.5.2土壤微生物测定 土壤微生物采用选择性培养基涂布筛选法：细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌用马丁-孟加拉红培养基，放线菌用改良高氏一号培养基，将土壤悬浮液按倍数(真菌10-3～10-1、放线菌10-5～10-3、细菌 10-6～10-4) 稀释涂平板后置于28 ℃的恒温培养箱中培养(细菌2～3 d、真菌4～5 d、放线菌5～7 d)后计数，3次重复[14-15]。

1.5.3土壤中酚酸类自毒物质测定方法 采用高效液相色谱(HPLC)法测定土壤中酚酸类自毒物质，对土壤中各酚酸和香豆素含量进行定性定量分析，待检测的酚酸包括绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸，香豆素。分析条件如下：高效液相色谱仪(Agilent 1100)，色谱柱(C18，PN 959990-902，5 μm，4.6 mm×250.0 mm)，流动相A：甲醇[16]。

1.6 数据统计

采用Microsoft Excel 2013软件对数据进行处理和作图；用SPSS 24.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小显著差异法(LSD)比较数据组间的差异，用Person相关系数评价不同因子间的相关性。用SPSS 24.0统计软件完成相关关系分析。

2 结果与分析

2.1 不同轮作处理对土壤养分的影响

紫花苜蓿轮作玉米和小麦后，土壤养分含量与CK相比均有不同程度的下降(表2)。轮作1年后，AC和AW的土壤有机质含量均显著低于CK(P<0.05)，较CK降低了17.29%和19.85%；AC的土壤全氮含量较CK显著减少了14.76%(P<0.05)；土壤全磷、全钾、速效钾含量在不同轮作处理之间差异不显著(P>0.05)；AC和AW土壤碱解氮含量比CK显著下降 23.82%和10.27%、速效磷显著降低 14.05%、8.04%(P<0.05)，两处理之间差异显著。轮作第2年，土壤养分消耗持续增加，土壤养分含量持续下降，和轮作第1年的变化趋势相近，轮作玉米对土壤有机质、全氮、碱解氮、速效磷的消耗量和轮作小麦相比显著增多(P<0.05)。ACC和AWW的有机质含量较CK显著降低了23.13%，26.23%(P<0.05)；ACC的全氮、全磷含量显著低于CK(P<0.05)，较CK分别降低了18.52%，35.61%；和CK相比，AWW的全氮含量显著减少了14.81%(P<0.05)；ACC和AWW土壤碱解氮含量比CK显著下降 31.03%和42.55%、速效磷显著降低8.93%、10.10%(P<0.05)。

表2 不同轮作处理条件下的土壤养分含量 Table 2 Contents of soil nutrients under the different grass-crop rotation treatments

注：同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column meant significant difference among treatments at 0.05 level, the same below.

2.2 不同轮作处理对土壤微生物的影响

紫花苜蓿与玉米、小麦轮作后土壤中微生物数量的变化如图1所示，不同轮作处理显著提高了土壤细菌的数量(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW比CK显著增加了34.75%、42.62%、69.00%、138.00%，轮作后土壤细菌数量增量大小顺序为AWW>AW>ACC>AC。紫花苜蓿轮作玉米、小麦后土壤真菌数量显著降低(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW显著低于CK，分别降低了48.96%、65.19%、66.72%、74.91%，而AW的土壤真菌数量与ACC之间差异不显著(P>0.05)。放线菌数量的变化趋势和细菌相同，AC、ACC、AW、AWW的土壤放线菌数量比CK显著增加了3.90%、13.38%、217.30%、314.32%(P<0.05)。

2.3 不同轮作处理对土壤酚类自毒物质的影响

不同轮作处理下土壤酚酸类物质和香豆素含量如图2所示，不同轮作处理下土壤自毒物质总含量显著低于CK(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW较CK分别降低了10.76%、25.23%、17.49%、37.46%，表明轮作小麦对酚类自毒物质的降解作用比轮作玉米大。轮作1年后，AC土壤中的阿魏酸变化不明显，绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸和香豆素含量比CK显著下降(P<0.05)，AW土壤中对羟基苯甲酸和香豆素含量显著低于AC(P<0.05)，其他自毒物质与CK相比差异不显著(P>0.05)，说明紫花苜蓿与玉米、小麦轮作1年能够减少土壤中自毒物质的含量，对羟基苯甲酸和香豆素的含量变化体现出轮作小麦比轮作玉米对土壤自毒物质的降解作用更大。轮作第2年，轮作土壤中的自毒物质含量均显著低于CK(P<0.05)，且低于第1年轮作处理，说明轮作第2年对自毒物质的消减效果更强，除了阿魏酸、咖啡酸，AWW的其他自毒物质(绿原酸、对羟基苯甲酸、香豆素)含量均显著低于ACC(P<0.05)，分别较ACC降低了19.62%、33.33%、12.50%。

2.4 土壤养分、土壤微生物数量和土壤自毒物质之间的相关性分析

2.4.1土壤养分与土壤微生物之间的相关关系 由表3可以看出，土壤中的细菌、放线菌与速效钾呈极显著负相关关系(P<0.01)，与有机质和全钾呈显著负相关关系(P<0.05)。真菌与有机质、碱解氮、速效磷、速效钾呈极显著正相关关系(P<0.01)，与全氮呈显著正相关关系(P<0.05)。

2.4.2土壤养分与土壤自毒物质之间的相关关系 由表4可知，土壤速效磷、速效钾和所有土壤自毒物质指标均呈极显著正相关关系(P<0.01)，有机质与绿原酸呈显著正相关关系(P<0.05)、与其他自毒物质指标呈极显著相关(P<0.01)。除了绿原酸，碱解氮与其余自毒指标都具有显著相关性(P<0.05)。

2.4.3土壤微生物数量与土壤自毒物质之间的相关关系 由表5可知，土壤中的细菌、真菌与所有自毒物质含量指标均具有显著相关性(P<0.05)。放线菌只与绿原酸、对羟基苯甲酸、香豆素、自毒物质之和具有极显著相关关系(P<0.01)。

表3 不同养分因子和3种微生物数量因子之间的相关性分析 Table 3 Simple correlation of soil nutrients and microorganism

*P<0.05,**P<0.01,下同。The same below.

表4 不同养分因子和不同自毒物质因子之间的相关性分析 Table 4 Simple correlation of soil nutrients and allelochemical

表5 3种微生物因子和不同自毒物质因子的相关性分析 Table 5 Simple correlation of soil microorganism and allelochemical

3 讨论

3.1 自毒物质与连作

紫花苜蓿的种子、根、茎、叶、花的组织及残根、枯枝落叶可以向土壤释放一定量的次生代谢物质，阻碍紫花苜蓿自身的萌发和生长[12]，被称为苜蓿的自毒作用。自毒作用是化感作用的种内形式，是作物产生连作障碍的原因之一。自毒现象直接影响紫花苜蓿草地的产量、管理、品质和经济收入。酚酸类物质和香豆素是紫花苜蓿常见报道的自毒物质，酚酸类物质在土壤中积累也是造成很多植物连作障碍的主要原因[17]。土壤中自毒物质含量会直接影响植物的生长，本研究表明轮作玉米和小麦后土壤中自毒物质含量呈不同程度的降低，说明轮作对紫花苜蓿自毒现象有一定的缓解作用，促进后茬作物的生长，轮作1年后已经表现出缓解作用，第2年消减强度更大；轮作小麦对自毒物质含量的消减幅度高于玉米。

有学者认为土壤养分下降是导致连作障碍的主要原因[18]，但通过施肥来缓解连作障碍，效果并不显著[19]。本研究发现紫花苜蓿轮作玉米、小麦后，土壤有机质、全氮、碱解氮、速效磷含量呈不同程度的下降，轮作玉米的消耗幅度显著增强，说明种植玉米加大了对土壤有机质、全氮、碱解氮和速效磷的消耗，种植小麦能够维持农田土壤肥力生长季平衡。研究报道土壤养分缺乏，植物会分泌更多的次生代谢物质[20]，但本研究发现轮作后土壤养分下降，土壤中酚酸类物质和香豆素含量也随之减少，表明土壤养分不是导致连作障碍的主要原因。通过典型性分析表明，土壤养分和土壤自毒物质之间没有显著相关性。轮作后次生代谢物质降低可能是后茬作物和紫花苜蓿分泌的自毒物质发生互作作用，也可能是土壤微生物钝化了自毒物质活性、改变了自毒物质的数量和种类。

3.2 土壤微生物与连作

自然条件下，在土壤中定殖着种类多样、数量庞大的微生物，植物的生长发育都与其有着密切的关系，微生物群落结构的稳定对于预防土壤病害的发生有重要的作用。有研究显示，连作作物的发病与其根际微生物群落结构失衡有关[21]，特别是与根际有益微生物和有害微生物的比例失衡有关[22]。本研究结果显示，轮作可以提高土壤细菌、放线菌的数量，降低真菌的数量。这一结果与前人得出的结论吻合，甄文超等[15]的研究表明草莓(Fragariaananassa)根际病害发生后，其根际真菌增加，细菌和放线菌数量减少。另有Benizri等[23]对桃树根部病害的研究也表明其发病与根际土壤中细菌的数量和种类降低、真菌的种类和数量提高有密切关系。综上，连作障碍的发生实际是土壤微生物群落结构失衡的过程，而这一过程，涉及环境、土壤、植物及其根际微生物等多个因子之间的非常复杂的相互作用，土壤微生物在这一复杂系统中发挥着关键作用。因此从土壤微生态系统角度出发研究连作障碍的发生，能从根本上阐明连作障碍发生机制并采取相应的调控措施加以防治。

3.3 自毒物质与土壤微生物

由表5可以看出，自毒物质与土壤微生物存在密切的关系。事实上，植株不论通过何种途径产生和释放自毒物质，最终其中的绝大多数都将进入土壤中进行迁移和转化。土壤微生物作为土壤自毒物质的循环调节者，是研究植株自毒作用活跃的生物因子[24]。土壤微生物主要通过对土壤中自毒物质进行代谢、降解以及利用来使其发生转变[25]，相互之间存在着拮抗和促进作用，有些微生物能使自毒物质的种类和数量发生改变，而有些自毒物质能改变土壤微生物分布等。植物根际分泌的自毒物质能改变根际微生物的种类、数量和分布，如棕榈酸使茄子(Solanummelongena)根际土壤中微生物数量和其组成比例发生变化，其中真菌降低，而细菌和放线菌升高[26]。微生物对自毒物质活性、转化及在土壤中的持久性起重要作用[5]。研究表明土壤微生物能修饰自毒物质的活性，使一些自毒活性物质转变为非活性物质，同时也能将没活性的物质转化为有活性的物质。同样，由于土壤中存在的酚酸物质引起的自毒作用，可以通过微生物代谢来降低有毒酚酸浓度或有机残余物中酚酸的释放速度，进而影响自毒作用的持续时间和大小[26]。在紫花苜蓿轮作过程中，土壤微生物和自毒物质之间的互作关系是如何发生的，其机理是怎样的，将是下一步研究的重点方向。

4 结论

5龄紫花苜蓿轮作玉米、小麦可有效降低土壤自毒物质绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、香豆素的含量，轮作第2年的消减自毒物质的效果强于第1年，同一年，轮作小麦的消减作用强于玉米。轮作后土壤微生物群落由真菌型向细菌型变化，土壤有机质、全氮、碱解氮、速效磷的消耗显著增加，种植玉米对土壤有机质、全氮、速效氮和速效磷的消耗显著强于种植小麦。结合轮作后土壤中自毒物质含量、土壤养分、土壤微生物的变化，得出紫花苜蓿轮作小麦能够维持农田土壤肥力平衡，在半干旱地区多年生苜蓿草地向农田转变过程中，以轮作小麦为宜，轮作1年小麦解毒效果明显，轮作2年更佳。