无创产前筛查在辅助生育双胎妊娠染色体非整倍体筛查中的应用价值

王东梅 杨洁霞 杜倩怡 王奕霞 彭海山 齐一鸣

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广州 广东 511442)

染色体疾病是导致我国出生缺陷的主要原因之一。产前筛查及产前诊断是预防出生缺陷的有效手段。胎儿染色体非整倍体的无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT) 是利用大规模平行测序技术对母体外周血中的胎儿游离DNA (cell free fetal DNA，cfDNA)进行深度测序，经过数据分析后，获取胎儿染色体信息的方法，具有安全准确的优势，近年来已在临床得到良好的应用[1]。目前已有大量文献证实NIPT在单胎妊娠常见染色体非整倍体筛查中的高准确性，其中21、18、13-三体的准确率分别是99%、97%、92%[2]。美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)最新声明指出NIPT能够在不同年龄人群中替代传统的非整倍体筛查方法，但双胎妊娠及辅助生育人群仍为该技术的慎用人群。由于ART双胎妊娠较为复杂，染色体非整倍体发生率及介入性检查流产率均比单胎要高[3]，而目前用于其染色体非整倍体筛查的血清学技术准确性较低，因此本研究通过检测cfDNA对ART双胎妊娠样本及自然双胎妊娠样本进行无创产前筛查，以评估其筛查ART双胎妊娠染色体非整倍体的可行性，同时也对ART双胎妊娠样本胎儿游离DNA 浓度进行分析，以评估它对ART双胎妊娠样本的无创产前筛查结果的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月至2018年8月在广东省妇幼保健院产前诊断中心接受NIPT检测的双胎妊娠孕妇样本，分为ART组和自然妊娠对照组，其中通过ART方式受孕的476例，自然受孕的对照组402例。本研究通过本院伦理委员会审核，孕妇在采血前均已签署知情同意书。其他纳入标准有：孕妇体重小于100 kg。夫妻双方染色体均无明确的异常。

1.2 研究方法 用无菌的EDTA.K2抗凝管采集孕妇外周血10ml，4℃条件下保存，并在6h内分离血浆。采用Magen磁珠法核酸提取试剂盒提取血浆游离DNA，以博奥晶芯胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒构建文库，Life公司Ion proton平台半导体测序法，进行NIPT测序分析。若Z值在-3～3之间则评估为三体低风险，若Z>3则评估为三体高风险。

1.3 检测后续处理NIPT高风险病例，建议孕妇行介入性产前诊断(羊水或脐血染色体核型分析)并随访；NIPT低风险病例，建议22～26周Ⅲ级超声多普勒检查，如发现胎儿有明显的结构异常，建议进一步产前诊断，如未发现异常则建议定期产检并随访；产后新生儿检查未发现异常的，视为阴性结果。未产前诊断及失访样本不纳入研究范围。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件处理数据，计量资料采用均数±标准差，计数资料采用频数(百分比)表达，组间比较采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本基本情况分析 878例样本按受孕方式分成2组，其中ART双胎妊娠476例，孕妇年龄22～50(32.86±4.52)岁，NIPT检查时孕周11～33(16.84±3.88)周；对照组自然双胎妊娠402例，孕妇年龄16～47(30.19±5.21)岁，NIPT检查时孕周11～32(17.93±4.31)周；t检验分析结果显示两组间孕妇年龄间有显著性差异(t=-8.124，P<0.001)，孕周间也有显著性差异(t=3.949，P<0.001)。两组一般情况对比见表1。ART双胎妊娠组高龄孕妇比例是36.1%，其中双绒毛膜双羊膜囊(dichorionic diamniotic，DCDA)和单绒毛膜双羊膜囊(monochorionic diamniotic，MCDA)比例分别为75.4%和3.4%，自然双胎妊娠组高龄孕妇比例是23.6%，其中DCDA和MCDA比例分别为40%和39.3%。

2.2 染色体非整倍体检出情况 本次研究NIPT高风险检出结果与后续核型分析具体情况见表2。ART双胎妊娠组染色体非整倍体阳性率为1.3%(6/476)，自然双胎妊娠组为0.5%(2/402)。

476例ART双胎妊娠样本中，一共检出7例三体高风险样本，检出率约为1.5%，分别为21-三体5例、18-三体1例、7-三体1例。进一步介入性产前诊断核型分析证实病例1、2、3、4、5、6为真阳性，均为双胎之一阳性，病例7为假阳性。同时检出1例病例8微缺失高风险样本，经产前诊断确定为假阳性；真阳性病例中，病例5、6孕妇年龄小于35岁，其余4例均为高龄妊娠，6例患者孕周从16～19周不等，胎儿浓度分别是7.5%、18.8%、30.6%、21.2%、13.1%、9.0%，绒毛膜性质均为DCDA。

402例自然双胎妊娠样本中，一共检出3例21-三体高风险样本，检出率约为0.7%。进一步介入性产前诊断核型分析证实病例9、10为真阳性，病例11为假阳性。2例真阳性病例均为高龄妊娠，孕周分别是16、18周，胎儿浓度分别是6.07%、19.8%，病例9未知绒毛膜性，病例10为DCDA。病例11为MCDA，胎儿浓度是5.4%。

表1 ART双胎妊娠组及自然双胎妊娠组孕妇一般情况

表2 高风险病例信息及核型分析结果

注：ART为辅助生育；NP为自然妊娠；BMI为身体质量指数；DCDA为双绒毛膜双羊膜囊；MCDA为单绒毛膜双羊膜囊

病例后续跟踪随访，T21、T18真阳性病例进行了减胎手术，本研究所检测的阴性样本中未出现染色体非整倍体假阴性的案例。ART双胎妊娠组结果阴性病例中有一例双胎之一心脏超声异常，经羊水染色体微阵列分析提示为22q11.21有一个大小约为3.15Mb的缺失。比较NIPT在两组中的筛查效能，具体情况见表3。

表3 NIPT对ART双胎妊娠及自然双胎妊娠的检测效能比较

2.3 胎儿游离DNA浓度分析ART双胎妊娠组平均游离DNA浓度为(12.51±5.96)%，自然双胎妊娠组平均游离DNA浓度为(15.35±6.71)%，见表4。t检验分析结果显示，2组间胎儿游离DNA浓度具有显著差异(t=6.624，P<0.001)。自然双胎妊娠组胎儿游离DNA浓度明显高于ART双胎妊娠组。

表4 2组间胎儿游离DNA浓度比较

3 讨论

随着高龄孕产妇的增加及辅助生育技术的发展，ART双胎妊娠发生率越来越高。接受ART的孕妇大多为高龄及胚胎进行了体外培养等因素，使得这类胎儿具有相对更高的染色体异常发治疗生率[4]，对于这部分孕妇有必要进行精准的产前筛查及产前诊断。然而，临床上广泛应用的多项血清学标志物结合孕妇年龄、体重等信息及超声软指标联合的产前筛查方法假阳性率较高[5]；侵入性产前诊断方法属于诊断金标准，但对于双胎妊娠容易造成出血、感染及流产[6]，且报告周期较长；ART妊娠胎儿本属于珍贵儿，血清学筛查无法满足ART孕妇的诊断需求，侵入性产前诊断又有流产风险，均难为孕妇接受。因此，临床上需要一种无创、快速、早期且准确地筛查双胎妊娠胎儿染色体非整倍体异常的方法。自1997年Lo等[7]发现母体血浆中存在cfDNA后，高通量测序技术在筛查常见染色体非整倍体方面(21、18、13-三体)发展迅速，其具有非侵入性、准确性高的优点，因此被广泛推广应用。但目前国内外学者对无创产前筛查的准确性和可行性评估主要是针对单胎妊娠进行，而针对辅助生育双胎妊娠群体的研究和运用较少。本研究利用高通量测序技术对ART双胎妊娠样本及自然双胎妊娠样本进行了无创产前染色体非整倍体的筛查，并成功筛查出8例染色体三体阳性样本。

本研究中，针对常见的21、18、13号染色体非整倍体异常，ART双胎妊娠组中T21、T18的PPV(阳性预测值)、灵敏度、特异度均为100%。由于样本量少，T13未检出，故未做统计；自然双胎妊娠组中T21的PPV(阳性预测值)、灵敏度、特异度分别为66.7%、100%、99.7%。因样本量少，未发现T18、T13，故未做统计。双胎妊娠组染色体非整倍体阳性率为1.3%(6/476)，自然双胎妊娠组为0.5%(2/402)，ART双胎妊娠组染色体非整倍体异常发生率较自然妊娠组高，可能与进行辅助生育技术的人群特点(不孕不育原因及高龄偏多)有关。

ART双胎妊娠组出现1例T7假阳性，自然双胎妊娠组出现1例T21假阳性。假阳性的出现原因有多种可能，包括母体染色体嵌合[8]、母体拷贝数变异[9]、早期双胎之一消失[10](辅助生育技术中为保证存活率通常会植入2个胚胎，其中可能出现一胎停育，一胎继续发育成双胎的现象，若消失的一胎染色体异常则可能造成假阳性)以及最常见的限制性胎盘嵌合[11]。本研究中，病例8的T7假阳性考虑原因是限制性胎盘嵌合，病例11的T21假阳性考虑原因是母体染色体嵌合，需要进一步验证。

研究发现ART双胎妊娠组提示一例20号染色体存在一个大小约22Mb的缺失，经产前诊断证实为假阳性；另外，在后续随访中发现ART双胎妊娠组NIPT结果阴性病例中有一例双胎之一心脏超声异常，经羊水染色体微阵列分析提示为22q11.21有一个大小为3.15Mb的缺失。该区域位于Digeorge综合征关键区域，孕妇经遗传咨询后接受减胎手术。NIPT目前的主要检测范围为21、18、13-三体综合征，在针对全基因组范围内筛查的同时可发现一些染色体微缺失/微重复，但由于cfDNA的复杂性及测序覆盖度等因素，容易出现假阳性/假阴性结果[12]。美国妇产科医师学会(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)指出对于cfDNA检测微缺失的筛查尚未被临床验证，其敏感性和特异性也没有确信数据[13]。国际产前诊断学会(International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD)则表示NIPT扩展检测应当限定在研究清楚的微缺失/微重复综合征范围内，并需要结合临床[14]。郭可欣等[15]表明使用NIPT检测5Mb以上，研究较明确的胎儿CNV具有一定的可行性。随着技术的发展，目前NIPT-PLUS通过增加测序深度、改进测序技术等可检测大于3Mb的微缺失/微重复。

Sarno等[16]的研究发现双胎胎儿部分的cf-DNA中位值较单胎低(8%比11%，P<0.0001)，取样失败率更高(9.4%比2.9%，P<0.0001)，且取样失败率随着母亲年龄及母亲体质量指数(body mass index，BMI)值升高而升高，随着CRL值增加而降低。取样失败中最重要的相关因素为体外受精(in vitro fertilization，IVF)，取样失败率在单胎中为9.5%，双胎中为56.2%。另外，双胎妊娠中cfDNA检测比单胎更加复杂。双胎妊娠按合子性质分为单卵双胎和双卵双胎，单卵双胎由一个受精卵分裂形成，大多数情况下，单卵双胎中2个胎儿的染色体核型是一致的，每个胎儿的患病风险与单胎妊娠相同。双卵双胎由两个受精卵分别发育而成，其中2个胎儿的患病风险是独立的，且较单胎妊娠高。但亦有报道单卵双胎两个胎儿核型不一致的情况，可能有以下两种解释[17]：一是减数分裂时染色体不分离导致形成一个24条染色体的配子与另一个正常的配子合成一个三体的受精卵，发育成双胎后其中一个胚胎发生三体自救，随机丢失一个额外的染色体，发育成二倍体胎儿(有1/3的概率形成单亲二倍体)，另一个胚胎没有发生三体自救，继续发育成三体胎儿；二是受精卵是正常的二倍体，双胎形成后其中一个胚胎染色体在有丝分裂中不分离，形成三体和单体两种细胞系，单体系死亡，三体系发育成三体胎儿，另外一个胚胎继续发育成一个正常的二倍体胎儿。若双胎中出现三体异常，通常只有其中一个胎儿受累，而两个胎儿分别对母血循环中贡献的cfDNA量不同，有些甚至可以相差近两倍[18，19]。若受累胎儿贡献的浓度低于cfDNA成功分析至少需要的4%，而正常胎儿贡献得多，则会导致假阴性的出现。因此，双胎中每个胎儿提供足够的cfDNA或能区分每个胎儿所占的胎儿比例是双胎筛查非整倍体的关键。梁德杨等[19]提出单核苷酸多态性测定基因组区域间胎儿部分的差异有助于判断双胎的合子性质，对双卵双胎，可以确定每个胎儿所占的胎儿比例，但应用于临床仍然有待进一步大样本研究。本研究中ART双胎妊娠组胎儿cfDNA浓度明显低于自然双胎妊娠组，可能是由于两者的孕周计算方式不同或者是辅助生殖技术植入的胚胎在孕妇体内生长发育速度不同于同期大小的自然双胎妊娠造成的。由于无创筛查的判断值(Z值)与母体血浆中胎儿游离DNA浓度呈一定的线性关系[20]，因此结果分析应该充分考虑双胎的绒毛膜性质及胎儿游离DNA浓度的影响。

综上所述，NIPT在筛查辅助生育双胎妊娠染色体非整倍体中有一定可行性，且不受孕周限制，但也存在假阳性与假阴性的局限性。对于阳性病例我们仍需进一步介入性产前诊断才可明确双胎中哪一胎受累，但在大多数双胎均正常的情况下，NIPT避免了不必要的侵入性检查，减少了孕妇的焦虑与担忧。NIPT阴性病例后续必须进行超声监测以及常规产检，发现异常及时就诊以及进一步产前诊断。同时本研究中由于样本数量较少，仅检出8例三体高风险，阳性率缺乏与单胎筛查的可比性。该技术在双胎妊娠中的临床应用仍需进一步大规模的临床数据支持验证。