Wistar大鼠肾结石模型血、尿生化的动态研究＊

郝志强，王勤章，钱 成，徐 浩，申茂磊，李 朋，钱 彪

在肾结石的基础与临床研究工作中，设计和建立合理的实验动物模型是重要的一环。通过建立肾结石实验动物模型可以深入了解肾结石的形成过程，研究肾结石的形成机制，印证或否定某一涉及结石成因的代谢问题，筛选抑制结石生长的药物并确认其临床药理等。由于动物实验易于控制实验条件，易重复，所以在临床与基础研究中得到广泛的应用［1，2］。该研究通过构建乙二醇 Wistar雄性大鼠肾结石动物实验模型，实时动态分析大鼠血、尿生化的改变，旨在为进一步肾结石形成机制及其病因学的深入研究提供数据资料及技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 自新疆医科大学实验动物中心购得SPF级［合格证号SCXK（新）2013-0001］、体重相近［（200±20）g］的 Wistar雄性大鼠 60 只，随机分为2组，乙二醇造模组与空白对照组，两组大鼠均先适应性饲养1 W，标准饲料喂养，饲料来源于石河子大学实验动物中心。

1.2 实验仪器与试剂 电子天平（LT1000B，江苏常熟市大量仪器有限责任公司）、全自动生化分析仪（Modual DPP，德国罗氏）、多功能光学显微镜及图像采集系统 （BX40，日本Olympus）、透射电镜（JEOL-1230 Electronics，日本 JEOL）。 试剂：1.25%乙二醇饮水、1%氯化铵等。

1.3方 法

1.3.1 模型建立及标本采集 将60只大鼠随机分为乙二醇组 （1.25%乙二醇饮水+1%氯化铵2 ml/d灌胃，30只）和空白对照组（正常饮水+生理盐水2 ml/d灌胃，30只），两组实验动物灌胃时间持续2 W，实验周期为10 W，每周每组各处死大鼠3只，处死前采集大鼠血、尿标本，供生化分析，并取两侧鲜活肾脏标本，供病理结晶情况检测及肾体比（肾脏重量/体重×100%）的计算。

1.3.2 记录大鼠一般情况 连续观察10 W内各组大鼠饮食饮水、行为活动等情况，并实时测量记录其体重变化。

1.3.3 病理切片 肉眼观察肾脏的颜色及其大小改变。将标本经固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片贴片、脱蜡染色、脱水透明、封固等步骤，制成石蜡病理切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察结晶的形成情况，按文献提供的肾脏结晶分级判定标准进行统计［1］。

1.3.4 生化指标 使用全自动生化分析仪检测肌酐，尿素，尿酸，尿钙，血钙，血镁，血磷等生化指标，进行统计分析。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料数据用±s表示，不同时间段的计量资料，组间分析运用重复测量的方差分析，相同时间段的组间比较用独立样本t检验，组内的比较采用SNK-q检验，显著性水准α=0.05，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况 造模初期1～2周，两组大鼠均表现无异，饮食饮水良好，且性情温顺。连续性观察，空白对照组3～10周造模期间，饮食及性情等均无没明显改变，而乙二醇组出现了阶段性的明显异常。第3～8周，乙二醇组大鼠烦躁兴奋、活泼好动，至第9～10周，乙二醇组大鼠表现为饮水量下降、精神倦怠、活动度明显下降、针刺反应迟钝，而且在造模期间乙二醇组大鼠垫料可见明显血尿痕迹，并有2只大鼠意外死亡。

2.2 大鼠肾脏标本肉眼观 动态观测10周内两组大鼠肾脏大体标本的改变，可见：空白对照组大鼠肾脏无明显改变，肾脏表面光滑，肾皮质剖面为暗红色，髓质呈灰白色，肾门处可见肾乳头、肾盏、肾盂等正常结构；第1～2周，两组大鼠肾脏无明显差异，自第3周开始，乙二醇组较空白对照组大鼠肾脏略有增大，肾皮质剖面呈红褐色，髓质呈橘黄色，皮髓结构清晰，肾盏及肾盂良好。第6周以后乙二醇组大鼠肾脏肿大，颜色变浅或发白，剖面呈淡黄色，皮髓结构不清晰，可见淡黄色颗粒沉积在皮髓交界处，触之有沙粒样感觉，在解剖显微镜下，晶体以肾盂为中心呈扇形分布。称重计算肾体比得：第3～10周乙二醇组肾体比与空白对照组肾体比有明显差异，且具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 大鼠肾脏光学显微镜观察 光学显微镜下可见：1～10周造模期间，空白对照组大鼠肾脏组织未见明显结晶；自第3周起，乙二醇组大鼠肾脏切片可见明亮晶体，主要分布于远曲小管，近曲小管及部分肾小球周围，形态不规则，晶体多呈零星散在分布，少量晶体互相连接成片成团。统计10周内两组结晶形成例数，计算成石率，结果显示两组之间成石率差异明显且具有统计学意义（P<0.05），见表2。因EG组大鼠在第3周开始成石，而前两周已处死的大鼠也存在成石的可能，所以在计算成石率时将前两周已处死的大鼠排除在大鼠总计数之外。

表1 乙二醇组与空白对照组肾体比记录（±s）

表1 乙二醇组与空白对照组肾体比记录（±s）

注：乙二醇组在对应时间点上f1～f8P与对照组比较，P<0.05；f1～f8P为乙二醇组与对照组比较的P值。Pf1=0.049，Pf2=0.041，Pf3=0.025，Pf4=0.048，Pf5=0.023，Pf6=0.015，Pf7=0.003，Pf8=0.009。

组别时间（w）10乙二醇组 0.63±0.01 0.76±0.05 0.92±0.09 0.95±0.08 0.98±0.06 0.98±0.07 1.01±0.10 1.00±0.09 0.95±0.02 0.97±0.06对照组 0.67±0.04 0.71±0.02 0.76±0.05f1 0.81±0.02f2 0.83±0.05f3 0.79±0.10f4 0.76±0.08f5 0.76±0.06f6 0.77±0.05f7 0.76±0.05f8 1 2 3 4 5 6 7 8 9

表2 乙二醇组与空白对照组结晶情况

2.4 血液生化分析比对 采集两组大鼠血液标本进行统计学分析，结果显示：血肌酐、血尿酸、尿素氮、血钙、血镁、血磷等重要指标均明显增高；乙二醇造模组大鼠血液分析，第2～10周尿素、肌酐、尿酸，第5～10周血钙，第6～10周血镁、血磷与空白对照组进行比较，差异明显，且均具有统计学意义（P＜0.05），见表3。其余各周差异无统计学意义 （P>0.05）。

2.5 尿液生化分析比对 收集两组大鼠尿液标本进行检测分析得：乙二醇造模组大鼠尿pH在第2～8周明显上升（图1），且与空白对照组差异有统计学意义（P＜0.05），乙二醇组大鼠尿钙水平自第2～10周，涨幅明显（P＜0.05）（表 4），其余各周无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。24 h尿量及尿比重显示，P＞0.05，无统计学差异。

表3 乙二醇组与对照组血液生化分析（±s）

表3 乙二醇组与对照组血液生化分析（±s）

注：在相应时间点上，乙二醇组与对照组比较，＊P＜0.05。

时间（周） 血钙（mmol/L） 血磷（mmol/L） 血镁（mmol/L） 肌酐（μmol/L） 尿酸（μmol/L） 尿素（mmol/L）乙二醇组1 2.46±0.11 2.46±0.10 0.93±0.08 39.37±1.82 80.33±9.87 5.45±1.54 2 2.52±0.09 2.50±0.06 0.97±0.16 41.77±1.37 72.00±5.29 5.80±1.18 3 2.56±0.05 2.66±0.02 0.99±0.14 40.73±3.18 77.00±2.65 4.49±0.35 4 2.63±0.04 3.08±0.09 1.00±0.17 42.63±3.04 78.67±8.74 5.99±0.37 5 2.81±0.14 2.92±0.25 1.13±0.22 52.83±4.05 81.33±6.11 5.93±0.79 6 2.68±0.08 3.55±0.17 0.80±0.04 47.40±7.81 89.33±4.16 6.40±0.36 7 2.67±0.11 4.45±0.33 1.60±0.17 50.40±3.06 81.33±11.68 5.84±0.21 8 2.66±0.12 3.88±0.32 1.58±0.25 45.80±6.37 86.67±3.21 5.13±0.21 9 2.53±0.11 4.54±0.26 1.70±0.20 49.33±3.23 79.67±3.21 5.47±0.46 10 2.87±0.03 3.85±0.29 1.73±0.19 46.37±4.57 75.67±6.66 6.18±0.49对照组1 2.34±0.16 2.79±0.57 1.10±0.20 39.43±1.43 78.67±9.71 5.89±0.68 2 2.39±0.11 3.54±0.87 1.18±0.31 42.40±6.46＊ 78.67±7.37＊ 5.71±1.10＊3 2.54±0.13 3.45±1.25 1.17±0.14 42.33±1.79＊ 72.67±4.73＊ 5.04±0.62＊4 2.49±0.10 3.45±0.23 1.24±0.10 42.10±3.70＊ 72.67±3.51＊ 4.91±1.17＊5 2.47±0.16＊ 3.34±1.22 1.13±0.45 42.53±4.93＊ 73.00±6.24＊ 5.72±0.87＊6 2.10±0.05＊ 2.90±0.35＊ 1.27±0.20＊ 45.03±4.32＊ 82.67±4.73＊ 5.68±0.42＊7 2.20±0.09＊ 2.71±1.03＊ 1.09±0.24＊ 50.43±7.21＊ 89.00±7.00＊ 5.53±0.13＊8 2.35±0.03＊ 2.46±0.34＊ 1.06±0.20＊ 49.53±3.79＊ 80.67±3.21＊ 5.28±0.46＊9 2.32±0.04＊ 2.58±1.14＊ 1.08±0.12＊ 46.53±5.35＊ 84.33±7.23＊ 5.75±0.66＊10 2.42±0.27＊ 2.59±0.42＊ 1.20±0.15＊ 47.07±1.46＊ 78.67±4.16＊ 5.70±0.87＊

图1 乙二醇组与空白对照组尿钙、pH比较

表4 乙二醇组与对照组尿液生化分析（±s）

表4 乙二醇组与对照组尿液生化分析（±s）

注：在相应时间点上，乙二醇组与对照组比较，＊P＜0.05。

（mmol/24 h） 尿pH 尿比重 24 h尿量（ml）乙二醇组1 1.09±0.07 7.17±0.29 1.013±0.003 6.67±1.202 1.13±0.09 7.33±0.29 1.010±0.005 7.77±2.143 1.60±0.25 7.67±0.29 1.012±0.006 8.13±1.844 2.00±0.78 7.50±0.50 1.015±0.005 8.87±3.175 2.35±0.52 7.50±0.50 1.013±0.003 9.47±0.876 2.35±0.18 7.33±0.58 1.017±0.008 9.53±1.317 2.20±0.28 7.67±0.58 1.015±0.005 9.07±1.008 1.98±0.26 8.33±0.29 1.015±0.005 9.27±1.359 1.88±0.04 8.33±0.29 1.015±0.009 8.47±1.16 10 2.08±0.15 8.00±0.50 1.015±0.005 8.80±0.87对照组1 1.11±0.16 6.67±0.29 1.013±0.006 7.70±0.872 1.00±0.05＊ 6.83±0.76＊ 1.018±0.008 9.03±1.023 1.59±0.27＊ 7.33±0.58＊ 1.018±0.003 11.30±2.884 2.22±0.16＊ 6.83±0.29＊ 1.018±0.003 10.90±2.195 2.15±0.30＊ 7.00±.087＊ 1.018±0.003 11.23±1.326 2.04±0.37＊ 6.67±0.58＊ 1.022±0.003 11.73±0.967 2.22±0.34＊ 7.00±0.50＊ 1.018±0.003 11.57±1.248 2.19±0.44＊ 6.80±0.29＊ 1.020±0.005 12.63±2.479 1.92±0.20＊ 6.83±0.29 1.018±0.010 9.77±0.85 10 2.01±0.21＊ 6.67±0.73 1.020±0.005 9.80±0.46时间（周） 尿钙

3 讨论

研究表明，泌尿系结石主要成分主要为尿中难溶的无机盐、酸、蛋白和一些糖类，概括起来为晶体和基质两部分，其中晶体占据绝大部分，主要为草酸盐、磷酸盐、尿酸盐和胱氨酸等，由此组成的结石中，以草酸盐最多见，约存在于90%的结石中；其次为磷酸盐，多数以羟基磷灰石的形式出现，磷酸镁铵则多见于感染性结石内。在肾结石的临床与基础研究中，大都通过构建乙二醇大鼠模型进行静态的研究，在最终造模结束后，对结石情况进行描述，从而缺乏了对结石形成过程的有效观察。本研究通过连续不间断的对大鼠血、尿生化进行分析，旨在为进一步结石形成机制的深入研究提供动态的实验数据与理论支持。

乙二醇为草酸的前体，亦是草酸代谢通路的中间产物，进入体内后可转化成羟乙酸，后者既可在羟乙酸氧化酶的作用下直接转化为草酸，也可通过乳酸脱氧酶的催化转化为乙醛酸，乙醛酸又可直接在非酶作用下转化为草酸。因此，摄入乙二醇可导致动物体内草酸增加而形成草酸钙［3-5］，从而成功构建Wistar雄性大鼠肾结石模型。氯化铵在酸化尿液的同时也具有肾毒性，长期服用可造成肾小管功能障碍，由此导致实验过程中乙二醇组有2只大鼠死亡，自第9周开始，饮食饮水减少，活动度减低，神情倦怠，针刺反应迟钝等情况的发生，许多研究表明肾小管上皮细胞的损害利于草酸钙结晶滞留和生长，与尿液中的其他成分共同启动结石形成的级联反应，这可能是结石形成的开端［6-9］。光学显微镜下，空白对照组未见明显结晶形成；乙二醇组结晶阳性16例，两组比较差异具有统计学意义 （P＜0.01）。

该实验中采集两组大鼠血液标本进行统计学分析，结果显示：血肌酐、血尿酸、尿素氮、血钙、血镁、血磷等重要指标均明显增高；乙二醇造模组大鼠血液分析，第2～10周尿素、肌酐、尿酸，第5～10周血钙，第6～10周血镁、血磷与空白对照组进行比较，差异明显，且均具有统计学意义。对两组大鼠尿液标本进行检测分析得：乙二醇造模组大鼠尿pH在第2～8周明显下降，且与空白对照组差异有统计学意义（P＜0.05），乙二醇组大鼠尿钙水平自第2周开始至第 10周，涨幅明显（P＜0.05）。由此说明，乙二醇及氯化铵营造的高浓度草酸环境和肾毒性作用，以损伤肾小管上皮细胞为起点，不断加重对肾脏组织的损害，加剧肾功能的不断下降［10，11］。

在造模初期，诸多重要指标测得表明大鼠肾脏均受到不同程度的损伤，笔者推测，一方面由于草酸成分的大量堆积，致使结晶沉积于肾脏微观结构中，以肾小管上皮细胞为起点，破坏肾脏正常机能，氯化铵的存在，其肾毒性对肾脏亦造成一定程度的伤害；另一方面，钙敏感受体受到刺激后表达上调［12，13］，抑制肾小管对钙离子的重吸收，从而增加尿钙排泄［14-16］，进一步加剧结石的形成。相较于之前的研究，笔者的实验进行改良，动态观测每一周血、尿生化的改变、结晶的形成情况等等，逐步明确肾结石的发展过程，实验的动态描述有利于进一步解释结石的形成机制，为肾结石病因学的研究提供原始数据及技术支持。