3-氢化松苓酸B对宫颈癌U14的影响

王爱玲 叶汪阳 汪鋆植,,3 吕慧芳 张宏岐,3 李平媛 李 湜 贺海波,

(1.三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443002;2.湖北省土家族药物研究所,湖北 宜昌 443002;3.湖北省生物酵素工程技术研究中心,湖北宜昌 443002)

宫颈癌是发病率最高的女性恶性肿瘤之一,且逐渐出现发病年龄年轻化、发病率不断升高的趋势[1-2].目前临床上治疗宫颈癌的主要方法是手术、放疗和化疗法[3],但目前大多数临床化疗药物毒副作用大.因此寻找有效且毒副作用小的抗宫颈癌药物,具有重大意义.3-氢化松苓酸B是从土家族药硫磺菌(Laetiporus sulphureus(Fr.) Murrill)中提取分离得到的一种活性物质,已发现其对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用[4].本研究评价TAB对U14细胞的抗肿瘤活性,并初步判断其体内毒副作用,为其用于肿瘤的临床治疗提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验药物

3-氢化松苓酸B(TAB)由本实验室提供,纯度98%,从硫磺菌中分离提取.动物实验时,直接将TAB用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度.

1.2 实验细胞株及动物

小鼠宫颈癌U14细胞株来自三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室;SPF级昆明小鼠60只,雌性,4～6周龄,体重18～22 g,购于三峡大学动物中心,实验动物生产许可证号为SCXK(鄂)2017-0012,饲养于三峡大学动物中心SPF级动物实验室,昆明小鼠适应环境1周后即进行成瘤实验,实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2017-0061.

1.3 试剂

DMEM培养基粉(1791922)购于美国Gibco公司;胎牛血清(20151209)购于杭州四季青生物材料有限公司;胰蛋白酶(9002077)、HEPES(7365459)购于美国Amresco公司;其他试剂均为市售分析纯.

1.4 实验仪器

双人单面净化工作台购于苏州净化设备有限公司;低速离心机购于长沙平凡仪器仪表有限公司;水套式CO2培养箱购于上海三腾仪器有限公司;O-lympus KX41型倒置显微镜购于美国Thermo公司.

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养

小鼠宫颈癌细胞株U14细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基培养,放在37℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中进行半开口的单层细胞培养.

1.5.2 小鼠宫颈癌动物模型建立

从含U14小鼠宫颈癌细胞的小鼠腹腔内抽取腹水,按1∶3的比例稀释并混匀,细胞悬液后取0.2 m L接种于昆明鼠腹腔内增殖,至第8 d抽取腹水,调整细胞浓度为1×107个/m L,取0.2 m L/只接种于随机选取的50只昆明鼠右侧背部近腋窝处皮下,接种后观察一周.待肿瘤长出后,每日测量肿瘤体积,待瘤体生长至大于100 mm3时,进行实验.

1.5.3 实验分组及指标观察

将接种细胞悬液的昆明鼠随机分成5组:模型组,阳性药雷帕霉素组(1 mg/kg),3-氢化松苓酸B高剂量组(120 mg/kg)、中剂量组(80 mg/kg)、低剂量组(40 mg/kg),每组10只;空白组为余下10只没有接种U14小鼠宫颈癌细胞的小鼠,分组后第2 d开始给药,每组昆明小鼠灌胃给予相应的药物,阳性药雷帕霉素组按照1 mg/kg的剂量腹腔注射给药,隔天注射,空白组和模型组灌胃给予相应的0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每天同一时间给药,连续灌胃10 d.第11 d处理动物.每天测量1次昆明鼠体重,并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等.分组后第2 d开始测量各组移植瘤的长度(L)和宽度(W),每2 d测量1次,肿瘤体积(V)=(L×W2)/2.称取瘤体重量,计算抑瘤率.抑瘤率=[1-(治疗组瘤重/对照组瘤重)]×100%.

1.5.4 肿瘤组织及其他脏器组织形态学观察

解剖各组小鼠,剥离各组小鼠的肿瘤组织、胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织,组织用4%多聚甲醛固定,之后组织脱水,石蜡包埋、切片,HE染色后,在光学显微镜下观察各组昆明鼠的肿瘤组织及其他脏器组织的形态学变化.

1.5.5 小鼠血液相关生化指标

小鼠进行眼球取血,室温静置半小时后,离心,取上清,分装后置于-80℃保存.然后根据市面购买试剂盒说明书进行血液相关指标的测定.

1.5.6 统计学处理

2 结 果

2.1 药物对U14细胞移植瘤昆明鼠一般情况的影响

用TAB治疗后,各组小鼠的进食、饮水及大小便均正常,活动正常,反应灵敏,精神状态良好,毛发正常,移植瘤组织没有出现溃烂.

2.2 药物对U14细胞移植瘤生长的影响

U14细胞接种3 d后,部分昆明鼠右侧后腿背部出现肉眼可见移植瘤,接种一周后每组10只昆明小鼠全部成瘤,开始给药.用药前,各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异.见表1,模型组的移植瘤生长迅速,给予TAB药物治疗后的昆明小鼠虽然其肿瘤体积仍在增长,但其增长速度较模型组相比明显缓慢,从第3 d开始,与模型组相比,3-氢化松苓酸B高剂量组(120 mg/kg)及中剂量(80 mg/kg)具有极显著性差异;至第5 d,与模型组相比,雷帕霉素组和3-氢化松苓酸B各剂量组均具有极显著性差异.且第11 d处理小鼠称取瘤重,计算抑瘤率,计算得雷帕霉素组抑瘤率为46%,3-氢化松苓酸B高剂量组的抑瘤率为50.9%,3-氢化松苓酸B中剂量组的抑瘤率为36.8%,3-氢化松苓酸B低剂量组的抑瘤率为30%.TAB高剂量组的抑瘤率较阳性药组略高.

表1 TAB对U14移植瘤生长的影响(±s,n=10)

表1 TAB对U14移植瘤生长的影响(±s,n=10)

与模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01

组别 肿瘤体积/mm3第1 d 第3 d 第5 d 第7 d 第9 d 第11 d瘤重/g抑瘤率/%模型组 296.0±63.1 553.4±66.7 1368.9±118.4 2317.2±285.4 3384.1±332.1 4856.2±357.5 4.8±1.0雷帕霉素组 319.5±81.4 483.7±90.3 794.6±86.5**1211.3±159.9**1655.2±236.6**2253.1±310.3**2.6±0.7**46.0 TAB(40 mg/kg)307.6±77.0 480.4±88.7 970.4±91.5**1817.5±130.1**2482.7±244.5**3423.2±274.7**3.4±0.9**30.0 TAB(80 mg/kg)274.9±77.8 429.3±77.6**854.5±98.3**1523.9±113.7**2259.5±169.6**2905.9±200.4**3.0±1.0**36.8 TAB(120 mg/kg)293.7±48.2 413.8±70.1**779.0±98.8**1259.1±104.4**1645.0±168.0**2132.6±243.7**2.4±0.8**50.9

2.3 TAB对U14移植瘤组织形态学的影响

由图1可见,模型组肿瘤组织细胞细胞核增大,核深染,病理性核分裂象多;用雷帕霉素及TAB治疗之后,肿瘤细胞数量明显减少,瘤细胞核分裂程度明显降低,在一个视野下,可见的正处于分裂期的细胞个数明显减少,并开始出现坏死区域,而且随着TAB剂量的增加,坏死区域面积显著增加.

图1 TAB对U14细胞移植瘤昆明鼠肿瘤组织形态学的影响(×10)

2.4 药物对U14细胞移植瘤昆明鼠一般情况的影响

用TAB治疗后,各组裸鼠的进食、饮水及大小便均正常,活动正常,反应灵敏,精神状态良好,毛发正常,移植瘤组织没有出现溃烂.

2.5 TAB对其他生化指标的影响

2.5.1 TAB对小鼠脏器指数的影响

由表2可知,TAB对小鼠的肾脏指数和胸腺指数没有产生较大的影响,模型组与空白组相比,其脾脏指数及肝脏指数显著性升高,TAB治疗剂量组与模型组相比,能够显著降低小鼠的脾脏指数及肝脏指数,对肿瘤移植引起的模型组的小鼠脾脏指数和肝脏指数的升高产生了逆转效果.

表2 TAB对小鼠脏器指数的影响(±s,n=10)

表2 TAB对小鼠脏器指数的影响(±s,n=10)

与空白组比较#P＜0.05,##P＜0.01;与模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01

组别 脾脏指数/% 肝脏指数/% 胸腺指数/% 肾脏指数/%空白组 0.33±0.01 6.04±0.39 0.28±0.05 1.26±0.10模型组 1.26±0.42## 8.08±1.07# 0.23±0.10 1.38±0.13雷帕霉素组 0.66±0.35** 6.19±0.97* 0.28±0.05 1.15±0.12 TAB(40 mg/kg) 0.87±0.25* 6.77±0.82* 0.23±0.08 1.11±0.14 TAB(80 mg/kg) 0.75±0.21* 6.70±0.97* 0.31±0.08 1.15±0.15 TAB(120 mg/kg) 0.79±0.37* 6.59±1.20* 0.26±0.11 1.14±0.26

2.5.2 TAB对小鼠血液生化指标的影响

如表3所示,通过对各组小鼠血液中的肌酐(CRE)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、葡萄糖(Glu)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量的测定.结果显示模型组小鼠肝功能异常、血脂代谢异常,甘油三酯含量升高,阳性药能够调节由于肿瘤引起的一些生化指标的改变,但是雷帕霉素能够极显著性的降低小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量;TAB给药后肝功能显著改善,甘油三酯含量下降.但值得注意的是TAB能够降低血液中葡萄糖,对代谢可能产生一定影响.TAB对肾功能没有明显影响.

表3 3-氢化松苓酸B对小鼠血液生化指标的影响(±s,n=10)

表3 3-氢化松苓酸B对小鼠血液生化指标的影响(±s,n=10)

与空白组比较#P＜0.05,##P＜0.01;与模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01

测定指标 空白 模型 雷帕霉素 TAB(40 mg/kg)TAB(80 mg/kg)TAB(120 mg/kg)CRE(umol/L)15.51±1.02 15.25±0.53 15.36±0.85 15.03±0.75 15.67±0.53 15.92±0.19 TG(mmol/L) 0.99±0.07 1.96±0.11## 1.92±0.24 1.82±0.05 1.80±0.11 1.60±0.05**T-CHO(mmol/L)3.26±0.01 2.63±0.09#3.48±0.24** 3.04±0.27 3.15±0.62 3.03±0.07 Glu(mmol/L) 7.27±0.48 6.07±0.27##7.14±0.29**5.08±0.02** 5.09±0.17** 4.93±0.03**HDL-C(mmol/L)4.08±0.21 3.19±0.01##1.29±0.06** 2.96±0.19 2.98±0.06 3.03±0.11 LDL-C(mmol/L)1.12±0.11 0.88±0.18 1.34±0.13** 0.99±0.13 1.02±0.10 1.05±0.18 ALT(U/L) 15.21±6.59 53.85±1.54##47.27±2.89*28.13±0.39**30.66±4.79**29.98±1.05**AST(U/L) 37.35±4.20 94.76±0.90##65.82±4.27**61.62±4.09**61.56±3.44**56.21±4.81**

2.6 TAB对昆明小鼠主要脏器的组织形态学影响

2.6.1 昆明小鼠心脏组织形态学分析

如图2所示,在光学显微镜下观察(×10),6组小鼠心肌细胞形态正常,心肌纤维排列紧密,排列有序.没有出现细胞水肿,未见炎症细胞和渗出.

图2 TAB对心脏组织形态学影响

2.6.2 昆明小鼠肝脏组织形态学分析

如图3所示,在光学显微镜下(×10),6组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞呈放射状围绕中央静脉排列,没有出现肝细胞肿胀、变性和坏死,细胞核呈圆形,大小正常,间质未见炎症细胞浸润,组织结构正常.

2.6.3 昆明小鼠脾脏组织形态学分析

如图4所示,在光学显微镜下(×10),空白组小鼠脾脏白髓、红髓分界清晰(蓝紫色为白髓,红色为红髓),模型组白髓数量相对密集,脾小体面积增大,可能与免疫反应增强有关.TAB给药组白髓区面积缩小,数量减少,而红髓面积增大.

2.6.4 昆明小鼠肺组织形态学分析

图3 TAB对肝脏组织形态学影响

图4 TAB对脾脏组织形态学影响

如图5所示,在光学显微镜下(×10),6组小鼠肺脏各级支气管和肺泡结构正常,清晰可见,上皮细胞完整,无缺失;肺泡腔内干净,未见出血,炎性渗出液,肺泡隔无增厚和炎性渗出.

2.6.5 昆明小鼠肾脏组织形态学分析

如图6所示,在光学显微镜下(×40),6组小鼠肾脏组织形态正常,皮质和髓质分界清楚,肾小管上皮细胞形态正常,未见管型和红细胞.

图5 TAB对肺组织形态学影响

图6 TAB对肾脏组织形态学影响

2.6.6 昆明小鼠胸腺组织形态学分析

如图7所示,在光学显微镜下(×10),6组小鼠胸腺小叶清晰可见,细胞大小正常,排列有序,皮质和髓质界限清楚.

图7 TAB对胸腺组织形态学影响

3 讨 论

宫颈癌是临床最常见的妇科恶性肿瘤,且是发病率最高的女性恶性肿瘤之一,在所有女性生殖系统恶性肿瘤患者中,其占比可达73%～93%.宫颈癌由于其恶性程度高,多易复发,而且死亡率高,使得当前已成为全球性的公共卫生问题[1,5].临床上运用顺铂与紫杉醇、博来霉素、阿霉素、长春新碱、异环磷酰胺、氟尿嘧啶等的一种或几种联合用药进行治疗.如顺铂与5-FU化疗,对局部晚期宫颈癌进行治疗,但效果不明显,甚至会造成肠胃道等不良反应产生.顺铂具有抑制细胞毒性与细胞DNA复制的作用,选择性较差,在杀灭肿瘤的同时对生长活跃的体内正常细胞也有不同程度的毒性.因此亟待找到一种毒副作用小且疗效良好的化疗药物.研究表明3-氢化松苓酸B具有有效、低毒潜质,具有开发利用前景,值得深入研究.

3-氢化松苓酸B是以土家族医“三元论”为指导,采用“反选法”筛选的有效的抗肿瘤药物[6].研究发现土家族药硫磺菌中含有大量3-氢化松苓酸B,而硫磺菌是一种土家族食药两用真菌,不仅食用味道鲜美,长期食用能够强身健体,而且有多种药用作用,如抗炎和抗肿瘤作用,已经有报道表明,硫磺菌菌丝体的粗多糖体内也有抑制小鼠Lewis肺癌作用[7].虽然硫磺菌的作用和安全性可能是多成分的综合作用,但硫磺菌的药食两用特性,在一定成程上反映了3-氢化松苓酸B的低毒性.通过U14细胞体内移植瘤实验,发现3-氢化松苓酸B可以显著抑制U14移植瘤在昆明小鼠体内的生长,病理学观察发现,给药剂量下3-氢化松苓酸B对小鼠的主要脏器形态学未产生影响.表明3-氢化松苓酸B抗肿瘤的有效性和低毒性.