莪术醇对结肠癌细胞HCT116的影响及作用机制研究

梁乔芳，廖小林，吴洪文*

(1.柳州市工人医院 药学部，广西 柳州 545005；2.柳州市中医院 骨科，广西 柳州 545001)

莪术醇来源于姜科植物莪术的根茎以及郁金的根茎。莪术具有行气破血、消积止痛的功效，主治血气心痛、饮食积滞、脘腹胀痛、血滞经闭、痛经、瘕瘤痞块、跌打损伤[1]。大量实验研究发现，莪术中的莪术醇能抑制肿瘤细胞增殖，发挥较好的抗肿瘤作用[2]。B淋巴细胞瘤-2基因简称bcl-2(B-cell lymphoma-2)，是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。Bcl-2可与Bcl-2家族的Bax形成同源的蛋白二聚体，而特定的蛋白二聚体则可作为在细胞死亡信号通路上的分子开关。罗吉等[3]研究发现，抑制结肠癌细胞可能通过改变BCL-2、Bax水平来实现，也可通过影响Caspase家族蛋白实现抗肿瘤作用[4]。故本实验以莪术醇为治疗药物，顺铂为阳性药，研究其对结肠癌细胞HCT116的影响以及相关作用机制，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 实验仪器

生物安全柜(BSC-1000IIA2，苏净安泰)；低温高速离心机(Eppendorf 5811，德国)；二氧化碳培养箱 (SHELDON3552-2，美国)；倒置显微镜(OLYMPUS IX71-22FL/PH，日本)；高压蒸汽灭菌锅(panisonic mLS-3751L-pc，日本)；恒温干燥箱(ZBY149-83，上海跃进医疗器械厂)全波长酶标仪(Thermo Scientific 1510，美国)；超纯水仪(CD-UPW-IV，成都越纯科技有限公司)；冰箱(博世冰箱BCD-254，德国)；超低温冰箱(Thermo Scientific Forma 900，美国)；恒温水浴锅(ZSXH-618，上海智城分析仪器制造有限公司)；液氮罐(ThermoFisherBio，美国)。

1.2 细胞株

人结肠癌细胞株HCT116购自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.3 药品与试剂

莪术醇(批号：20180525，纯度≥98.0%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)； RPMI 1640培养液(广州洁特生物过滤股份有限公司，批号：180301-377)； Hank’s Balanced Salt Mixture(索莱宝，批号20180429)；胰酶(Gibco，美国)；青链霉素混合液(索莱宝，批号20180512)；胎牛血清(四季青，批号20180518)；CCK8(日本同仁)；BAX(批号AA368876)、Bcl-2(批号AA656642)、Caspase9(批号AA126876)兔抗人单克隆抗体、二抗为抗兔(批号AA126544)，均购自bioworld公司。FDA染色剂(Sigma公司，批号：F7378)；顺铂注射液(山东齐鲁制药有限公司，批号：6A002A88)；BCA试剂盒、ECL发光液均购自上海碧云天有限公司。

2 方法

2.1 HCT116结肠癌细胞的培养

用长镊子从液氮罐里取出装有HCT116的冻存管，在37 ℃水浴锅里，摇晃1 min，使之全部融化，然后加入一定量的含10%的血清和1%青链霉素混合液的高糖培养基(完全培养基)，1 000 r/5 min离心，弃去上清液，加入完全培养基，吹打混匀后移至培养瓶，在37 ℃，5%CO2无菌培养箱里培养，一般4 h细胞完全贴壁，48 h后传代。丢弃细胞培养废液，用Hank's清洗两遍，注意动作轻柔，防止洗掉贴壁细胞，加入适量胰酶并在显微镜下观察，等到细胞开始变得圆润并且开始脱落，加入完全培养基终止消化，1 000 r/5 min离心，加入完全培养液分装至培养瓶。一般稳定传2～3代后，即可用细胞开展实验。

2.2 莪术醇对HCT116结肠癌细胞增殖的影响

取对数生长细胞，按照8×103个细胞接板至96孔板，每孔加100 L，分为空白对照组、阳性药组、莪术醇高、中、低组，6个复孔。空白组加不完全培养液，阳性药组加含有5 μmol/L 顺铂的不完全培养液，给药组分别加100、50、25 μg/mL的莪术醇，37 ℃，5%CO2孵育24 h，分别加入以上对应组，24 h后加入10% cck8，1h后在450 nm测得OD值。按照以下公式计算出存活率，其中细胞存活率=(剂量组OD值-对照组OD值)/对照组OD值× 100%。

2.3 不同剂量的莪术醇对HCT116结肠癌细胞的FDA染色

取对数生长细胞，按照每孔4×106个细胞接板至6孔板，每孔加2 mL，分为对照组，阳性药组，10、25、100 μg/mL 莪术醇剂量组，共5个组，3个复孔。37℃，5%CO2孵育24 h，对照组只加不完全培养液，3 h后，弃去所有培养液，用Hank’s轻柔清洗两遍，给药组分别给予对应剂量药物，FDA染色后，荧光显微镜观察细胞生长形态学特征并拍照。

2.4 Western Blot法检测不同剂量莪术醇干预HCT116结肠癌细胞BCL-2、BAX、Caspase9蛋白表达

2.4.1 细胞处理 细胞稳定传代后，加完全培养液，细胞铺满培养瓶，空白组不完全培养液，阳性药组和莪术醇组分别用不完全培养液稀释药物。剂量按照“2.2”项下方法设计。干预24 h后，弃去培养液，以Hank’s轻柔清洗两遍，胰酶消化后，离心收集细胞。每管加入1 mL裂解液，充分震荡后，冰水里裂解30 min，取上清液转移至新的EP管中。

2.4.2 蛋白含量测定 取5 mg/mL BSA(牛血清白蛋白)标准品10 μL用去离子水稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL。分别取标准品0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液(去离子水或PBS缓冲液)补足至20 μL，此时BSA标准品浓度分别为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/μL。加适当体积样品至96孔板的样品孔中，若样品不足20 μL，需加标准品稀释液(去离子水)补足至20 μL，记录待测孔所加样品的体积。加200 μL显色液，孵育15 min，采用酶标仪检测，计算蛋白含量并确定最终上样量。

2.4.3 样品处理 使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，按照样本∶缓冲液=4∶1混匀，沸水煮20 min，放室温后转移到-20℃冰箱保存。

2.4.4 制胶 本实验选用12%压缩胶，5%分离胶。

2.4.5 上样与电泳 将样本拿出恢复到室温后，震荡混匀后，将蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 本实验采用SDS-PAGE过程恒压的方式，通常电压设置为100 V，1 h。

2.4.6 转膜 使用0.22 μm的PVDF膜，设定转膜电压为110 V，转膜时间为110 min。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，故将转膜槽放置在冰浴中。

2.4.7 封闭 转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(1X TBS-T溶液)中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的转膜液。转膜完毕后应特别注意膜的保湿，避免膜干燥，否则极易产生较高的背景。用滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(5%脱脂奶粉)，在摇床上缓慢摇动，37 ℃封闭1 h以上，室温封闭2 h以上。对于一些背景较高的抗体，可以4 ℃封闭过夜。

2.4.8 一抗孵育 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(1X TBS-T溶液)稀释一抗。封闭后，弃去封闭液，1X TBS-T溶液洗膜，洗去封闭液即可。

2.4.9 二抗孵育 加入稀释好的二抗，室温或4 ℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2 h，37 ℃下1 h。 回收二抗，加入1X TBS-T溶液，在摇床上缓慢摇动洗涤5～10 min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5～10 min。共洗涤3次。若结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

2.4.10 蛋白检测 本步骤称为曝光、洗片、显色或显影。采用化学发光法进行显色，将孵育二抗并清洗完毕的PVDF膜置于天能5300凝胶成像系统内。取等体积的发光液A和发光液B混匀，均匀撒在PVDF膜上，运行凝胶成像系统的软件，选择化学发光，设置曝光时间，拍照并保存。

2.5 统计学方法

实验数据采用SPSS22.0进行统计学处理，用t检验分析各个组之间的差异，求得标准偏差表示其浮动范围，求得P值，按照P<0.05标准判定组间有差异。

3 结果

3.1 莪术醇对HCT116结肠癌细胞增殖的影响

不同剂量莪术醇对HCT116细胞干预24 h后，对其抑制率有不同的影响。干预浓度升高，对细胞的抑制率也升高。其中阳性药组细胞存活率为22.5%，高、中、低莪术醇剂量组细胞存活率分别为35.4%、58.2%、83.1%。 具体见表1。

表1 不同组别结肠癌细胞活性比较

3.2 莪术醇对HCT116结肠癌细胞BCL-2、BAX、CasPase9蛋白表达的影响

图1A为各组蛋白电泳图，B、C、D分别为BAX、CasPase9、BCL-2蛋白表达水平柱状图。与空白组相比，阳性药组细胞Bax、casPase9表达水平显著提高(P<0.01)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.01)，莪术醇高、低剂量组细胞BAX水平显著提高(P<0.05)，莪术醇高、中剂量组细胞casPase9水平显著提高(P<0.01)，Bcl-2水平显著降低(P<0.01)。见表2。

图1 不同组别 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表达水平

表2 不同组别结肠癌细胞 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表达水平比较

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 不同组别结肠癌细胞FDA染色

空白组细胞生长密集，阳性药物组细胞稀疏，效高、中、低剂量莪术醇组细胞分别呈密集到稀疏趋势。具体见图2。

图2 不同组别HCT116结肠癌细胞FDA染色

4 讨论

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄段发病率最高，男女比例为2～3∶1，发病率为胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌，大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。

研究发现，莪术醇能明显抑制结肠癌细胞增殖，并且可能对凋亡蛋白有一定影响。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，其涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。细胞凋亡并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。Bcl-2家族、caspase家族与细胞凋亡密不可分。

本研究结果表明，莪术醇能提高结肠癌细胞HCT116凋亡蛋白BAX、Caspase9的表达，降低抗凋亡蛋白BCL-2的表达[5-6]，且在CCK8细胞活性检测以及FDA染色中表现出较好的抑制作用及形态学变化。综上所述，莪术醇对结肠癌细胞HCT116有一定抑制作用，可能是通过影响凋亡蛋白的表达而发挥抗癌作用。