HPLC法同时测定半夏泻心汤标准煎液中黄芩苷和盐酸小檗碱含量

2019-03-21张莹莹季巧遇李诒光吴样明

亚太传统医药 2019年2期

张莹莹，季巧遇,*，李诒光,，吴样明，李青

(1.江西中医药大学药学院，江西南昌 330004；2.江中药业股份有限公司，江西南昌 330096)

半夏泻心汤出自东汉张仲景《伤寒论》，由半夏、黄芩、黄连、干姜、人参、甘草、大枣七味药组成，是用于心下满而不痛之痞证的治疗方，现代临床多用于治疗慢性胃炎、功能性消化不良、溃疡性结肠炎、急性胃肠炎、肠易激综合征、反流性食管炎、糖尿病胃轻瘫、呃逆等疾病，在胃肠道疾病方面有广泛的治疗效果。黄芩，黄连为方中苦降药，均具有清热燥湿、泻火解毒功效，与辛开药半夏干姜配伍使用，对寒热互结、胸腹闷胀、心下痞满等症有治疗效果。有文献[1]对半夏泻心汤胃内滞留片中黄芩苷、盐酸小檗碱分别进行含量测定，但没有对其在同一色谱条件下进行含量测定的报道。本实验参考相关文献[2-5]，建立了同时测定标准煎液冻干粉中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱的含量测定方法，为更好地控制产品质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(HPLC)，包括1260 DAD 检测器；MS-204S型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；CPA-225D型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；科昌达超声波(南昌科昌达超声波设备厂)；pH计(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

1.2 药品与试剂

半夏泻心汤标准煎液冻干粉(自制，批号：20180706、20180708、20180710)；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201613，纯度：86.8%)、黄芩苷对照品(批号：110715-201318，纯度：93.3%)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸等所用试剂均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Zorbax Eclipse SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸(B)(加入三乙胺调pH值=2.5)，梯度洗脱(0～5 min，12%A；5～10 min，12%→20%A；10～20 min，20%→27%A；20～25min，27%→31%A；；25～30min，31%→35%A；流速：1.0 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下进样测定，理论板数均大于5 000，分离度均大于1.5，各成分基线分离良好。色谱见图1。

图1 黄芩苷、盐酸小檗碱高效液相色谱

2.2 溶液制备

2.2.1 黄芩苷、盐酸小檗碱对照品溶液制备精密称取对照品黄芩苷9.65 mg，加甲醇溶解，定容至10 mL；盐酸小檗碱10.79 mg，加甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，取1 mL再用甲醇定容至10 mL，得黄芩苷、盐酸小檗碱浓度分别为0.900 3、0.093 66 mg/mL对照品贮备液；再分别精密量取黄芩苷、盐酸小檗碱对照品贮备液适量于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液中黄芩苷、盐酸小檗碱的浓度分别为0.108 0 mg/mL、0.011 24 mg/mL。

2.2.2 供试品溶液制备取冻干粉样品0.1 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解，超声(功率：250 W，频率：60 kHz)提取40 min，放冷，用80%甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得。

2.2.3 阴性对照溶液制备按半夏泻心汤标准煎液的处方和制备工艺分别制备缺黄芩、缺黄连的阴性对照样品冻干粉，再按照“2.2.2”项下供试品制备方法制成阴性对照样品溶液。

2.3 线性关系考察

取“2.2.1”项下0.900 3 mg/mL黄芩苷、0.093 66 mg/mL盐酸小檗碱对照品贮备液，用甲醇稀释至黄芩苷45.0、72.0、108.0、162.1、180.1 μg/mL，盐酸小檗碱4.7、7.5、11.2、16.9、18.7 μg/mL的系列混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进行实验，混合对照品溶液进样量各10 μL，记录黄芩苷、盐酸小檗碱色谱峰峰面积。以混合对照品质量浓度(mg/mL)为横坐标X、峰面积(A)为纵坐标Y进行线性回归方程计算，得黄芩苷、盐酸小檗碱回归方程分别为Y=28427X-50.42(r=0.999 2)、Y=19981X+0.5717(r=0.999 8)。结果表明，黄芩苷、盐酸小檗碱检测质量浓度线性范围分别为45.0～180.1、4.7～18.7 μg/mL。

2.4 精密度试验

取半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号：20180706)，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理，按照“2.1”项下液相色谱条件连续进样6次测定指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.26%、0.43%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号：20180706)，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理，按照“2.1”项下色谱条件，分别于放置0、2、4、6、8 h时进样测定，记录峰面积，计算指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为 0.58%、0.64%(n=5)，表明样品溶液在8 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

分别取6份半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号：20180706)，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理，按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定，记录峰面积，计算指标成分含量。结果样品中指标成分黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.71%、1.32%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

分别取6份半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1 g(批号：20180706)，精密称定，置于50 mL容量瓶中，依次加入质量浓度0.7438 mg/mL的黄芩苷对照品溶液3.5 mL、0.234 1 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液1.2 mL，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理，再按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定，同时计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收实验结果 (n=6)

2.8 耐用性试验

按照 “2.2.2”项方法，取同一份半夏泻心汤基准煎剂冻干粉，平行制备 2 份样品，按照“2.1”项下色谱条件，采用不同温度(20℃、25℃、30℃)、不同流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)、同一品牌不同批次的色谱柱(Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720、Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL017852)对相同样品进行 HPLC 分析，计算含量，并进行比较。

结果表明，Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720柱，流速1 mL/min，不同柱温时，测得半夏泻心汤基准煎剂冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.37%、1.99%，对含量测定无显著影响。不同流速时，测得半夏泻心汤基准煎剂冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.84%、1.82%，对含量测定无显著影响。采用同一品牌不同批号的色谱柱检测半夏泻心汤冻干粉中黄芩苷、盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.15%、14.98%，色谱柱变化对盐酸小檗碱含量测定有显著影响，且采用Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL017852色谱柱测的盐酸小檗碱分离度不佳。

2.9 样品含量测定

分别取3批半夏泻心汤标准煎液冻干粉样品0.1g(批号：20180706、20180708、20180710)，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法进行样品前处理，再按照“2.1”项下色谱条件对样品进行含量测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (n=3，mg/g)

3 讨论

3.1 色谱柱选择

笔者首先探索了DIASONSIL-C18柱对本品指标含量黄芩苷、盐酸小檗碱的分离情况，发现在不同流动相条件下两个成分的峰形不佳，因此换用Zorbax Eclipse SB C18S.N.USCL072720柱进行实验，在此色谱柱条件下黄芩苷、盐酸小檗碱出现较好峰形。

3.2 检测波长选择

对样品进行全波长扫描发现黄芩苷在275 nm处有最大吸收，随着波长的升高或降低，黄芩苷吸收值下降，盐酸小檗碱分别在340 nm和235 nm有最大吸收，又继续考察了235 nm、275 nm、340 nm波长条件下两个指标成分的对称因子、分离度、塔板数等指标，发现275 nm波长条件下分离度、塔板数等均较其他两个波长好，因此选择275nm波长作为本实验的最终波长。