JMJD1A促进胶质瘤增殖侵袭的分子机制探究

刘坤 许惠娟 管瑛瑛 陈桓 张福汉 宿杰阿克苏 侯英勇 许建芳

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的一种恶性肿瘤，具有高侵袭性、高复发率和高死亡率等特点[1-3]。尽管研究者在胶质瘤恶性进展方面开展了大量研究，目前临床仍然没有有效的治疗和早期诊断策略。据报道，JMJD1A的表观遗传调控在精子发生、新陈代谢、性别决定、干细胞自我更新和分化等生物过程中起着不同的作用[6-12]。目前，JMJD1A已经被发现在多种肿瘤中发挥重要作用，但是在胶质瘤中还未见报道。本文旨在进一步了解JMJD1A在胶质瘤增殖侵袭过程中的作用，期望为胶质瘤的诊断治疗提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 脑胶质瘤标本收集

收集2016年1—12月复旦中山医院手术切除并经病理科确诊为脑胶质瘤的10例临床组织标本。

1.2 Western Blot实验

配制12%分离胶与4%浓缩胶，SDS PAGE电泳1.5小时，电流为浓缩胶25 mA，分离胶30 mA。转膜，脱脂奶粉封闭，一抗4℃过夜，二抗37℃孵育1小时，暗室内曝光显影。

1.3 细胞株及主要试剂

胶质瘤细胞株购于中科院上海细胞生物所；Western-blot抗体购于CST公司；MTS试剂盒购于Promega公司；Transwell试剂盒购于Millipore公司；siRNA购于上海吉凯公司。

1.4 细胞株培养

人胶质瘤细胞系U87和U251用10%的胎牛血清DMEM培养基进行培养，并加入青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/L），置于37℃ 5%的CO2培养箱内培养。

1.5 细胞转染

细胞汇合度至70%～90%时，用DharmaFECT进行细胞转染。实验为3组，未处理组细胞（Mock）加入培养基，阴性对照组（siC）加入无意义序列，JMJD1A干扰组（siJMJD1A）加入JMJD1A特异性干扰序列siRNA。

1.6 MTS增殖实验

每隔24小时，每孔加入20ulMTS试剂37°C培养箱继续培养4 h，最后在490 nm波长进行吸光度检测。

1.7 细胞Transwell侵袭实验

将500 μL转染细胞制备的无血清悬浮液加入到每个小室的内部（8 μm孔径），10%FBS的500 μL培养基添加到下层孔内。孵育24 h后，穿过膜的下层膜细胞用Gimesa染色20 min，显微镜下计数。

1.8 统计学分析

应用GraphPad Prism5统计学软件，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验，不符合正态分布的计量资料，采用非参数秩和检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 JMJD1A在胶质瘤组织中显著过表达

通过Western Blot 方法和搜索 TCGA数据库，发现与正常脑组织相比，胶质瘤中JMJD1A的蛋白和mRNA水平显著升高（P＜0.01，图1）。该结果提示该基因可能参与胶质瘤发生发展过程。

2.2 siRNA干扰降低胶质瘤细胞中JMJD1A的表达

接下来选取了两株胶质瘤细胞系 U87和 U251。利用siRNA干扰细胞中 JMJD1A的表达。Western Blot结果显示，与未处理组细胞（Mock）和对照组细胞（siC）相比，siRNA可显著降低细胞中JMJD1A蛋白表达水平。

2.3 干扰JMJD1A表达显著抑制胶质瘤细胞增殖能力

图1 胶质瘤中JMJD1A蛋白及mRNA水平检测

图2 JMJD1A干扰效率检测

图3 干扰JMJD1A表达对细胞增殖速率的影响

图4 干扰JMJD1A表达对细胞侵袭能力的影响

本研究使用MTS方法检测JMJD1A对胶质瘤细胞增殖的影响。MTS结果显示，与未处理组Mock与对照组siC相比，JMJD1A干扰组细胞（siJMJD1A）增殖速率显著降低（P＜0.05，图3），说明JMJD1A下调可以显著抑制胶质瘤细胞的增殖能力。

2.4 干扰JMJD1A表达显著抑制胶质瘤细胞侵袭能力

Transwell结果显示，与未处理组Mock与对照组siC相比，JMJD1A干扰组细胞（siJMJD1A）侵袭细胞数量显著降低（P＜0.05，图4）。结果说明JMJD1A下调可抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。

3 讨论

胶质瘤是死亡率最高的中枢神经系统肿瘤。在过去的十年里，由于肿瘤分子生物学技术的进展，胶质瘤的分型发生了巨大的变化[1]。目前，胶质瘤的治疗主要是手术治疗和放化疗治疗。其中，手术切除肿瘤通常是首选的治疗策略。然而，高级别胶质瘤如胶质母细胞瘤，由于其增殖侵袭等特点，使得手术不能到达完全治愈的效果，患者极易复发，且预后很差[2-3]。JMJD1A这种组蛋白去甲基酶，会参与细胞表观遗传调控[4-5]。研究发现JMJD1A在多种肿瘤中都存在异常表达并发挥着促进肿瘤的作用，如前列腺癌、结肠癌、肝细胞癌和肉瘤[6-12]。本研究在胶质瘤组织中，发现JMJD1A表达水平存在显著增加的现象。通过siRNA干扰技术降低了胶质瘤细胞系中JMJD1A的表达水平。进一步通过体外分子方法检测干扰JMJD1A表达后胶质瘤细胞增殖侵袭的变化。本研究结果证实了JMJD1A下调能显著抑制胶质瘤细胞的增殖侵袭能力。本研究可为胶质瘤的临床诊断及治疗靶点提供潜在的理论依据。