妊娠期慢性疼痛对母鼠认知功能影响机制研究*

周 芳 黄 悦 李 清 涂淑敏 刘玉平

（1徐州医科大学护理学院，徐州 221004； 2北京清华长庚医院麻醉科，北京 102218；3徐州医科大学附属医院护理部，徐州 221002）

国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain, IASP)将疼痛定义为一种与组织损伤或潜在组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验。持续或间歇性持续3个月以上的疼痛被定义为慢性疼痛(chronic pain,CP)[1]。慢性疼痛持续时间长，治愈率低，导致病人机体功能失调，免疫力下降，从而诱发各种并发症，严重影响病人的生活质量，增加家庭负担，给社会也造成巨大损失[2]。

本课题组前期人群调查发现，慢性疼痛可造成孕妇发生焦虑和抑郁[3]，并导致其产程延长，出血量增加、新生儿Apgar评分较差[4]。在动物实验中，我们发现了与人类调查极为类似的结果[5,6]。但近期我们在慢性疼痛模型的受孕小鼠中发现，其认知能力（学习、记忆）也有显著下降，且具体机制不明。因此，本研究拟通过构建孕期小鼠慢性炎性痛模型，用水迷宫实验观测孕鼠认知行为，用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测慢性疼痛对孕鼠单胺类神经递质水平的影响，并通过实施优裕胎教方案对慢性疼痛进行干预，以揭示妊娠期慢性疼痛对孕鼠认知功能影响的机制。

方 法

1.材料

实验所用动物均为SPF级昆明小鼠，由徐州医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（江苏）2002-0038。选用未受孕过的雌性小鼠，65～90日龄，25～35 g，同批交配（交配用成年雄性小鼠，25～45 g），10～12 h后发现阴栓或阴道涂片发现精虫者定为妊娠第 0天。选取40只成功受孕小鼠，随机分为四组（每组10只）：正常对照组、假手术对照组、慢性疼痛组、慢性疼痛（下简称“慢疼”）+优裕胎教组。

2.方法

（1）孕鼠慢性疼痛模型的制备

慢性关节炎疼痛模型[5]：母鼠交配成功后当日（妊娠第0天），在七氟烷麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点皮内注射完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant, CFA) 100 μl (500 μg)，该注射可诱导产生慢性关节炎(chronic arthritis, CA)。在注射后的24 h（妊娠第1天，即疼痛造模第1天）即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持4周以上，覆盖母鼠整个孕期（22 d左右）及产后1周。分别在造模后第0、1、3、7、14、21、28 d，用热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。监测仪器：IITC series 8, IITC Co., LTD., USA）来评估疼痛，确保动物在各时间点处于相同疼痛水平。假手术对照组孕鼠用同样麻醉方式、同样注射方法、同样注射部位注入同体积无菌PBS。

（2）饲养方式

常规饲养方案：单笼单只饲养，鼠笼周围环境温度23±1℃，相对湿度以50%～60%，食物充足，自由摄食饮水，昼夜均衡，直至分娩后3周。

优裕胎教饲养方案：将慢性疼痛+优裕胎教组孕鼠放置于宽敞的鼠笼中饲养，每笼1只。笼中摆放有云梯、滑绳等供孕鼠啃咬木头，在常规饲养的基础上还额外提供花生、葵花子、坚果等，同时将小鼠置于节奏舒缓的音乐中（6 h/d，音量控制在50～60分贝）[7]。

（3）痛相关递质水平检测

在母鼠孕第6 d、12 d、18 d、生产当日、产后6 d分别用ELISA法检测其血清中5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)水平。

（4）孕鼠认知行为监测

Morris 水迷宫水30 cm深，室温、水温均保持在(25±1)℃。将水池分为4个象限，将无色透明的平台固定在第3象限中央，位于水面下1 cm。摄像头置于水池中央的上方约2 m处，自动采集小鼠游泳轨迹图像信息并传入计算机进行分析处理。本研究在给孕鼠造慢性疼痛模型后6～12 d用Morris水迷宫监测其认知行为状况，其中定位航行实验检测其学习能力，空间搜索实验检测其记忆能力。

定位航行实验：历时6 d。训练第1 d让小鼠自由游泳以熟悉环境，上下午各1次，每次时间为60 s。从第2 d起正式检测，每只小鼠测试4次/天，每次将小鼠面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳轨迹及时间（逃避潜伏期，escape latency）。如小鼠在60 s内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期计为60 s。取小鼠四次逃避潜伏期的算术平均数作为其当天的平均逃避潜伏期(average escape latency)。每次训练完，用干毛巾将小鼠擦干（注意避免对其腹部的按压和刺激），以防止低体温造成的应激，让小鼠休息60 s后开始下一次训练。

空间搜索实验：在定位航行试验结束后撤除平台，从第2象限将小鼠放入水中，记录小鼠60 s内搜寻平台的运动轨迹、在原平台所在象限的停留时间和游程占总时间（时间比率）和总游程（游程比率）的百分比、平均游速和穿越原平台区的次数。

3.统计学处理

实验数据采用SPSS 23.0统计软件分析处理。计量资料以均数±标准差(±SD)表示。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用事后检验LSD法（资料均符合正态性和方差齐性）。计数资料用百分比(%)表示，多组间比较采用卡方检验。按检验水准α = 0.05，当P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.慢性疼痛对孕鼠认知行为的影响

（1）慢性疼痛对孕鼠学习能力的影响：定位航行实验结果显示，从训练第3天至第6天，与正常对照组、假手术对照组和慢疼＋优裕胎教组孕鼠相比，慢性疼痛组孕鼠平均逃避潜伏期均较长（P＜ 0.05，见图1）。

（2）慢性疼痛对孕鼠记忆能力的影响（见表1）。

2.慢性疼痛对孕鼠神经递质水平的影响（见图2）

与假手术对照组相比，慢性疼痛组孕鼠在整个孕期与产后6天其外周血中5-HT与DA水平显著降低（P＜ 0.05，见图2A、2B）。与慢性疼痛组相比，慢疼＋优裕胎教组孕鼠在围产期各时间点5-HT与DA水平显著增高（P＜ 0.05，见图2A、2B）。

讨 论

慢性疼痛常伴有认知功能的改变，如慢性疼痛病人常主诉学习、记忆障碍，近80%的慢性疼痛病人认为自己学习记忆能力减退[8]。本研究在受孕小鼠慢性疼痛模型中发现，孕期慢性疼痛可导致孕鼠认知能力下降，优裕胎教可有效改善其认知能力。

当疼痛发生时，冲动信号通过丘脑部分传递到大脑皮层，并由中央后回（大脑负责疼痛感觉的区域）接收。其他冲动传递到脑干的网状结构，大脑边缘系统和广泛的大脑皮层（包括额叶，顶叶和颞叶），它们进行综合、分析信号，最终命令身体通过情绪活动和有意识的运动来应对疼痛[9]。在这些信号的传导过程中，介导疼痛的递质如5-HT、DA不仅参与疼痛的调控[10]，对学习记忆也有重要的调节作用[11]。5-HT通过轴突投射广泛释放到大脑中枢神经系统，调节大脑皮质的兴奋状态，参与人类的认知、情绪和运动等许多生理过程[12]。海马中5-HT与认知功能密切相关，在海马长时程效应增强和记忆改善中起重要作用，是维持智力的重要神经递质[13]。DA 可以减少氧化应激损伤，增加脑部血流供应，改善脑部神经元利用葡萄糖，在突触可塑性和学习记忆形成的调节系统中发挥重要作用[14]。本研究发现，伴随认知能力的下降，慢性疼痛组孕鼠5-HT、DA递质水平从孕6天开始逐渐降低，生产当日达到最低水平，产后有所增高。与假手术对照组相比，慢性疼痛组孕鼠5-HT、DA水平显著降低。而优裕环境下饲养的慢性疼痛孕鼠，其认知能力与慢性疼痛组孕鼠相比有显著改善，同时各时间点其5-HT、DA水平与慢性疼痛组孕鼠相比亦显著增高。这提示5-HT和DA可能是慢性疼痛导致孕鼠认知能力下降的机制之一。

表1 各组孕鼠空间搜索能力比较 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

表1 各组孕鼠空间搜索能力比较 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，与假手术对照组比较；△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，与慢性疼痛组比较*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, compared with the sham group; △ P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01, compared with the CP group.

穿越平台次数Number of crossing the platform(times/60s)游速Swimming speed（cm/s）时间比率Time ratio(%)游程比率Distance ratio(%)正常对照组Normal 4.61±1.33 21.32±1.20 42.93±3.27 46.28±2.92假手术对照组Sham 4.69±1.69 22.17±1.99 41.64±3.36 43.53±3.59慢性疼痛组CP 1.24±1.35** 19.42±1.52* 25.33±3.83*** 26.69±2.67**慢疼+优裕胎教组CP + EEI 3.32±1.56△ 20.27±1.66 34.39±2.57△△ 36.82±3.39△△

图2 (A)各组孕鼠在不同时间点5-HT水平的比较; (B)各组孕鼠在不同时间点DA水平的比较aP ＜ 0.05，与正常对照组比；bP ＜ 0.05，与假手术对照组比；cP ＜ 0.05，与慢性疼痛组比Fig.2 (A) Comparison of 5-HT level of pregnant mice in each group at different time points.(B) Comparison of DA level of pregnant mice in each group at different time points aP ＜ 0.05, compared with the normal group; bP ＜ 0.05, compared with the sham operation group; cP ＜ 0.05, compared with CP group.

本项目的完成揭示了妊娠期慢性疼痛对母体认知功能产生不利影响的机制并提供了干预策略，为临床患有慢性疼痛的孕妇的无创、非药物性干预提供了实践依据，为改善分娩结局，提高出生人口素质，促进母婴健康提供了有力支持。