肠道菌群与骨量变化的研究进展

马思聪 郝永强 富灵杰

随着高通量测序技术迅猛发展，肠道菌群的相关研究日趋增多。在骨骼生长发育中，肠道菌群通过调节营养吸收和代谢产物，改变肠黏膜上皮结构以及介导免疫细胞活化等方式成为调节人体骨骼代谢的重要途径。细菌丰度和多样性的变化作为其中的重要机制，通过介导钙离子与维生素D的吸收、诱导破骨细胞增殖与分化、释放短链脂肪酸与氨基酸等小分子物质等途径进行骨调节。本文就肠道菌群与骨量变化的研究进展作一综述。

1 肠道菌群

胃肠道内含有人体内种类最多、密度最大的微生物群落。肠内容物中的微生物总量超过机体生殖细胞与体细胞总和的10倍，而遗传物质总量甚至多达100倍[1]。肠道微生物绝大部分由细菌组成，主要分为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门4类，其中丰度最高的厚壁菌门和拟杆菌门超过细菌总量的98%[2]。肠道的稳态平衡很大程度上依赖于肠道的内环境[3]、宿主基因[4]、肠道黏膜[5]、pH值[6]、抗生素[7]和饮食物质等，这些因素的改变均会导致肠道菌群的丰度与多样性发生变化。

肠道菌群可以对肠内容物中残余的多糖进行分解代谢，产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸[8]。其中，丁酸可调控组蛋白去乙酰化酶发挥乙酰化作用，控制表观基因表达，进而诱导肠道调节性T细胞的增殖分化[9-10]，增强免疫应答，调控破骨细胞分化。除此之外，肠道菌群还能将未被机体吸收的大分子营养物质分解为单糖、肽类及脂肪酸等有机小分子，这些小分子物质能够经肠道黏膜上皮入血发挥内源性生理作用。同时，再次消化产生的代谢产物，如磷酸盐、维生素B族、维生素K和四氢叶酸等，可借助生化修饰和重新合成的功能参与宿主的生理、免疫功能的发展与调控[11-12]。小肠上段菌群还可以促进上皮细胞增殖，增加存活率，调节肠道屏障，进而影响肠黏膜内外的物质交换[5,13]。

2 肠道菌群与骨量变化

2.1 微生物相关分子模式

微生物相关分子模式(MAMP)是能够被机体非特异性免疫系统识别的病原微生物成分，包括细胞壁、鞭毛、无细胞RNA以及细菌分泌的肽聚糖、脂多糖、鞭毛蛋白等。其进化保守，易于识别。当MAMP的分子量足够小，它们就能穿过肠内皮屏障进入体循环。例如，细菌细胞壁的主要成分脂多糖与鞭毛蛋白可分别与骨细胞免疫受体Toll样受体(TLR)4和TLR 5结合，介导非特异性免疫反应，影响骨重建。Smith等[14]在一项炎症性骨丢失模型的研究中发现，干预处理脂多糖可造成骨密度与骨体积分数的降低，骨骼中的细胞炎性介质如环氧化酶(COX)-2、白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α上调。研究表明，脂多糖可通过慢性炎症反应诱导骨量下降发生[15]。胞壁酰二肽(MDP)是革兰氏阳性和阴性细菌中肽聚糖共享的最小结构单元[16]，MDP及其衍生物可以与免疫识别受体[如核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)2受体]结合，增强疫苗佐剂活性与抗肿瘤活性，促进免疫应答[17]。MDP也可以通过调节NF-κB受体激活因子(RANKL)与骨保护素(OPG)的表达，下调RANKL/OPG比值，间接抑制破骨细胞分化，以增加骨密度及骨矿含量[18]。

2.2 无菌小鼠及粪菌移植实验

近年来，利用特有繁殖方式与饲养环境培育出的无菌小鼠被较多应用于肠道微生态与疾病的研究中。Sjögren等[19]利用断奶后的无菌小鼠(C57BL/6J)研究肠道菌群和骨量的相关性，结果显示，无菌小鼠松质骨和皮质骨的骨量均高于同月龄、同品系常规条件饲养(CONV-R)小鼠，两种小鼠的骨转换因子也出现显著性差异。该研究结果首次证明，肠道菌群与小鼠骨量具有相关性。他们对无菌小鼠进行粪菌移植后发现，其骨量逐渐降低并与CONV-R小鼠的骨量水平相当，这与骨髓中特异性CD4+T细胞和破骨前体细胞数量增加有关[19]。另一项研究也得出类似结果。研究发现，与20周龄雌性CONV-R小鼠相比，无菌小鼠(C57BL/6J)的皮质骨与骨小梁的骨体积水平均更高[20]；而给予断奶后的CONV-R小鼠低浓度抗菌药物处理后，其骨密度在短时间内显著升高，表明肠道内微生物可能对骨量变化具有负向调节作用[21]。然而，Schwarzer等[22]对8周龄雄性BALB/c小鼠的研究有不同结果。他们发现，新生CONV-R小鼠的体长、体质量、骨量、皮质骨厚度和股骨长度均高于无菌小鼠与抗菌药物处理小鼠，而且这种趋势在断奶后更加明显，这可能由于肠道内的细菌代谢为新生雄鼠的骨量增长与生长发育提供了更合适的内环境。虽然上述研究结果并不完全相同，但均能证明肠道菌群可通过某种机制参与小鼠的骨骼生长发育调节，而调节差异可能由小鼠的性别、品系、笼养条件以及所用饲料不同所造成。

由于肠道微生态短时调整的研究结果存在差异，有学者对肠道微环境持续改变对骨代谢的影响进行了长期观察。Yan等[23]在长达8个月的小鼠粪菌移植实验中发现，肠道菌群对小鼠的骨形成与骨吸收作用随移植时间延长有不均等的影响。他们采用成年杂合CB6F1小鼠，将CONV-R小鼠的粪菌通过拭子法移植到无菌小鼠体内。1个月后，移植组小鼠与对照组(未进行处理的同源无菌小鼠)相比骨量明显下降，而生长板厚度增加，这表明粪菌移植在短期内促进了小鼠的骨吸收与软骨骨化；8个月时再次对比发现，移植组中不论雌鼠还是雄鼠，其股骨长度与L5椎体高度均大于对照组，其中内外骨膜的增长水平雄鼠比雌鼠表现更加明显。通过对骨转换因子水平的测定，他们发现，微生物在粪菌移植初期会同时介导骨形成与骨吸收相关因子增加，导致骨转换暂时加快；随着移植期变长，则对骨形成的影响占主导地位，促进了小鼠长骨的纵向与径向生长，使骨量趋于均衡，且发现其作用机制可能与雌激素水平相关。

2.3 去势实验

采用去势或药物干预来建造绝经后骨质疏松动物模型是目前研究骨质疏松症的常用方法。对小鼠进行药物去势后，无菌小鼠骨量与对照组(CONV-R小鼠)和移植组(移植了CONV-R小鼠粪便的无菌小鼠)相比，减少程度更低，骨转换加速和破骨细胞活化因子增多的程度更低，即小鼠的无菌状态可以防止类固醇激素水平下降所引起的骨小梁减少[20]。无菌小鼠肠道内派尔氏淋巴结发育不全，肠黏膜免疫系统的淋巴生发中心面积减小，产生IgA的浆细胞数量和固有层 CD4+T 细胞数量减少，免疫应答作用降低，使雌激素介导的骨吸收作用减弱[24]。同时，接受粪菌移植的无菌小鼠骨量减少程度与 CONV-R小鼠无差异，这表明无菌状态下建立的初生免疫系统与骨丢失的预防无明显相关性。

肠道菌群主要通过介导炎症反应，调节激素代谢及肠上皮营养物质转运等途径作用于骨骼系统。肠上皮黏膜通透性改变也是引起小鼠去势后骨量改变的机制之一[20]。雌激素减少使肠黏膜通透性增加，致辅助性T细胞17增多，小肠与骨髓中的破骨相关因子TNF-α、RANKL和IL-17的表达水平升高，这些因子通过介导炎症反应刺激骨吸收。肠道菌群通过合成短链脂肪酸影响钙吸收相关蛋白质来调节骨代谢。体内和体外实验均证明，短链脂肪酸可增加人与鼠的结肠上皮Caco-2细胞的钙结合蛋白D9K与瞬时性受体电位通道香草酸受体6(TRPV6)的转录水平[25]。肠道菌群亦可通过降低肠腔内pH值，抑制磷酸钙等络合物形成[26]，升高游离钙离子浓度来增加钙吸收。肠道微生物对钙剂吸收的影响还表现在调节紧密连接蛋白的表达[20]与肠上皮细胞的增殖[27]来提升离子交换效率。肠道微生物可通过脑-肠轴作用于内分泌系统以调节宿主的激素水平[28]。一项无菌小鼠的粪菌移植实验显示，在小鼠骨量增长的同时伴有血清胰岛素样生长因子-1水平的显著增加[23]。此外，肠道菌群还可作用于肠嗜铬细胞，增加外周5-羟色胺的生物合成[29]，通过激素样作用刺激或抑制骨形成[30-31]。

2.4 益生菌

动物实验结果显示，益生菌具有良好的提升骨量作用。研究显示，在肉鸡饲料中添加芽孢杆菌可促进其骨矿化，增加胫骨强度[32-33]。罗伊氏乳杆菌通过调节宿主细胞的免疫应答来减少破骨相关细胞因子抗酒石酸酸性磷酸酶和RANKL的产生，预防机体由于绝经后雌激素大量减少造成的骨量流失[34-35]。去势小鼠模型研究显示，术前服用复合乳杆菌可降低TNF-α和IL-1β的表达，增加OPG的表达，从而达到预防手术去势诱导的小鼠皮质骨丢失的效果[36]。长链双歧杆菌可通过提高成骨细胞因子防止去势小鼠的骨量减少[37]，增加长骨的矿化程度[38]；添加鼠李糖杆菌可以促进幼年斑马鱼的骨骼钙化，并能够刺激Runt相关转录因子2和丝氨酸蛋白酶7、丝裂原活化激酶1和3、基质GLA蛋白和骨钙素，抑制骨硬化蛋白，通过多种机制共同促进骨形成过程[39]。

益生菌在肠道菌群介导的骨质疏松动物模型中对骨量改变起到积极的正向调节作用，针对肠道微环境的干预疗法可能成为治疗骨质疏松疾病及其并发症的新途径。

3 展望

增加骨量，提高骨骼强度，预防骨质疏松性骨折是治疗骨质疏松症的最终目标。肠道菌群与骨量变化的相关性已得到初步证实，然而，其中的调节机制尚需要进一步研究。益生菌在增加骨量方面的基础研究为骨质疏松症的预防与治疗提供了新的方案和思路，未来尚需进一步研究其作用机制以及最适合的肠道菌群调节方法。通过干预肠道菌群来调节全身骨代谢是未来防治骨质疏松症，维系骨健康的一个新的途径和方法。