白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞侵袭实验研究

李国远 郭煜 罗正亮 郝永强 尚希福

骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤之一，以癌性成骨细胞分化和恶性类骨质为特征，青少年时期发病率最高[1-2]。目前用于人类骨肉瘤治疗的化疗方案涉及多种化疗剂的组合，如高剂量甲氨蝶呤与亚叶酸钙、多柔比星，顺铂与异环磷酰胺、依托泊苷。虽然近几十年来这些方案在骨肉瘤化疗中发挥了重要作用，但尚无一种方法可以使生存率有重大改善[3-6]。此外，这些方案仅被证明在局部骨肉瘤治疗中有效，而它们在转移性和复发性骨肉瘤治疗中表现不佳[7-8]。

骨肉瘤的发展是复杂、多步骤、多因素的过程，其中肿瘤微环境和先天免疫系统的炎症细胞释放出许多因子如促炎细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-8、转化生长因子(TGF)-β等参与其中，这些因子均影响肿瘤细胞增殖、凋亡和肿瘤侵袭[9-11]。

在新型抗肿瘤药物的研究中，生物活性天然产物已获得了相当多的研究关注。白藜芦醇是源自葡萄等植物的中药有效成分，可在各种类型癌症治疗中发挥作用[12-13]。此外，有研究发现白藜芦醇还可以在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中抑制干扰素(IFN)-γ或脂多糖诱导产生的炎症反应[14]。然而，迄今尚未阐明白藜芦醇在骨肉瘤侵袭和迁移过程中的作用及其潜在作用机制，因此本研究拟初步探索白藜芦醇对骨肉瘤的抗肿瘤作用及其潜在的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞株：人骨肉瘤细胞系HOS、MG63、Saos2和U2OS购自中国科学院(中国上海)。

主要试剂：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清、青霉素、链霉素(澳洲Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶/EDTA(美国Gibco公司)，聚合酶链式反应(PCR)相关试剂盒(日本TaKaRa公司)，流式检测试剂盒(广州赛业生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)，Transwell小室(美国Costar公司)，Matrigel胶(美国BD Biosciences公司)，白藜芦醇(R5010，美国Sigma-Aldrich公司)。

主要仪器：细胞培养箱、低温高速离心机、超净工作台、ABI型快速实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，酶标仪(美国Bio Tek公司)。

1.2 细胞培养

人骨肉瘤细胞系HOS、MG63、Saos2和U2OS均在DMEM培养基中培养，培养基中加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，在37°C、5%二氧化碳(CO2)的湿润气氛中培养。所有使用细胞均在20代内。

1.3 细胞增殖实验

将细胞移出并悬浮在培养基中，将8 000个细胞接种到96孔板中，并在细胞黏附后用0、10、20、40 μmol/L浓度的白藜芦醇处理。在白藜芦醇处理24、48、72 h后，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后向每个孔中加入100 μL DMEM和10 μL CCK-8溶液，37°C孵育2.5 h。以经0 μmol/L白藜芦醇处理的细胞作为对照。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。实验重复3次。

1.4 细胞凋亡实验

将骨肉瘤细胞以每孔2×105个接种于6孔板中，并用20 μmol/L白藜芦醇处理，24 h后收获。用冷PBS缓冲液洗涤细胞2次并离心。弃去上清液，将细胞重悬于膜联蛋白结合缓冲液中。膜联蛋白V-APC和碘化丙啶染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 细胞侵袭实验

在Transwell小室中将约1×105个细胞接种到涂有Matrigel胶(1∶3稀释)的小室(直径6.5 mm，孔径8.0 μm)上，并保持在含有0.2%牛血清白蛋白(BSA)和DMEM细胞培养液中，分别加入浓度为0、10、20或40 μmol/L的白藜芦醇。将含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液加入下室中。在37°C、5%CO2气氛中温育32 h后，用PBS缓冲液洗涤小室，并用棉签擦拭小室内表面的细胞，迁移至室外的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染色，并进行显微镜检查。细胞计数以200倍视野下随机拍摄各组图像的5个视野进行平均计数。

1.6 实时荧光定量PCR方法检测骨肉瘤细胞侵袭相关基因表达

将骨肉瘤细胞消化并重悬于培养基中，将1×106个细胞接种到6孔板中，并用浓度为0、10、20、40 μmol/L的白藜芦醇处理72 h。使用AxyPrep Multisource Total RNA Miniprepkit分离总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒将等量的RNA转化为cDNA。使用ABI 7500测序检测系统和SYBR Premix Ex Taq进行实时荧光定量PCR，以经0 μmol/L白藜芦醇处理的骨肉瘤细胞作为对照。循环条件为40个循环，95°C持续5 s，60°C持续34 s。引物序列见表1。

表1 定量引物序列

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。使用单因素方差分析(ANOVA)评估组内数据整体差异的显著性，各组间差异比较采用最小显著性差异法(LSD)检验。数据表示为平均值±标准差，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制骨肉瘤细胞增殖及促进骨肉瘤细胞凋亡

白藜芦醇相对分子质量为228.24，其结构如图1所示。为研究白藜芦醇对骨肉瘤细胞的作用，使用CCK-8法和流式细胞术实验进行细胞增殖和凋亡分析。用0、10、20和40 μmol/L浓度的白藜芦醇处理HOS、MG63、Saos2及U2OS细胞，24、48、72 h后OD值见表2。所有细胞经白藜芦醇处理后增殖均受到抑制，且白藜芦醇对HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性(图2)。流式细胞术实验结果进一步证实白藜芦醇具有促进骨肉瘤细胞凋亡的作用(下页图3)。

图1 白藜芦醇结构示意图

表2 经白藜芦醇处理后骨肉瘤细胞的OD值

*表示与对照组相比，P<0.05

2.2 抑制骨肉瘤细胞侵袭

进行Transwell细胞侵袭实验检测经不同浓度的白藜芦醇处理后骨肉瘤细胞的侵袭能力。实验结果表明，白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤细胞侵袭(下页图4)。

2.3 下调骨肉瘤细胞基质金属蛋白酶基因表达

为探索白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞侵袭分子机制，使用实时荧光定量PCR检查基质金属蛋白酶(MMP)基因表达的变化。用0、10、20和40 μmol/L浓度的白藜芦醇处理HOS、MG63、Saos2及U2OS细胞后MMP1、MMP2及MMP9基因的相对表达水平见下页表3。这提示经白藜芦醇处理后HOS、MG63、Saos2和U2OS骨肉瘤细胞中MMP1、MMP2和MMP9的基因表达水平以剂量依赖性的方式降低(下页图5)。实验结果表明，MMP1、MMP2和MMP9是白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞侵袭的作用靶点。

图3 白藜芦醇促进骨肉瘤细胞凋亡

图4 白藜芦醇以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞侵袭

3 讨论

骨肉瘤是一组异质性恶性肿瘤，其特征在于存在不同程度的间充质分化。目前骨肉瘤临床治疗面临两大挑战。首先，尽管手术前后化疗可以提高5年生存率，但与化疗相关的毒性反应和不良反应可能会显著降低患者生活质量[15-16]。其次，骨肉瘤复发和转移率很高，这是大多数骨肉瘤患者预后不佳的主要原因[17]。骨肉瘤早期极易发生远处转移，90%转移累及肺脏，在临床诊断明确时多已成为高等级的恶性肿瘤[18]。早期发生转移是导致骨肉瘤预后差的重要因素，存在肿瘤转移的患者远期生存率仅为10%～30%。其他与预后相关的因素包括原发肿瘤部位与大小、早期手术干预效果及对化疗的敏感性等。随着对骨肉瘤发生发展认识的不断深入，其转移及侵袭机制也逐渐成为研究热点。因此，探索调控骨肉瘤转移及侵袭的信号靶点，并以此进行针对性干预，确定毒性较小且更有效的治疗方案，将有望提高骨肉瘤的临床疗效及预后。目前越来越多的注意力集中在天然产物在骨肉瘤治疗中的应用。

表3 经白藜芦醇处理后骨肉瘤细胞MMP1、MMP2及MMP9基因表达

*表示与对照组相比，P<0.05

白藜芦醇是从植物中提纯的生物活性成分之一，是一种多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的植物抗毒素。目前进行的肿瘤治疗研究明确了白藜芦醇的药理作用，如可抑制脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤炎症[19]。白藜芦醇通过促进肿瘤细胞凋亡来抑制肝脏恶性肿瘤生长[20]。因此，白藜芦醇可能是治疗炎症和肿瘤的潜在有效选择。然而，白藜芦醇在影响骨肉瘤侵袭中的功能和潜在机制至今尚未阐明。

我们的研究目的是探索白藜芦醇是否具有抗人类骨肉瘤活性的能力。实验结果显示，白藜芦醇以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡。研究发现，白藜芦醇抑制肿瘤发生发展的作用机制包括抗氧化活性、清除自由基、抑制DNA合成、阻滞细胞周期并诱导肿瘤细胞分化及诱导肿瘤细胞凋亡[21]。白藜芦醇的这些干预作用可能与活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)上调相关。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在细胞凋亡中起着不可替代的作用。caspase-3可被多种因子激活，是细胞凋亡过程中主要的末端剪切酶[22-23]。白藜芦醇促进骨肉瘤细胞凋亡的具体作用机制有待后续实验进一步探索。

由于转移是骨肉瘤治疗中的挑战之一，我们还观察了白藜芦醇对骨肉瘤细胞侵袭的作用。研究发现，白藜芦醇可有效抑制骨肉瘤细胞的侵袭，可能在骨肉瘤治疗中具有抑制其转移的能力。此外，通过对肿瘤转移相关基因的表达分析发现，在白藜芦醇作用下MMP1、MMP2和MMP9基因表达受到明显抑制。MMP1、MMP2和MMP9基因在骨肉瘤转移中非常重要[24-25]，它们可能是白藜芦醇作用于骨肉瘤细胞的靶点，但确切的作用机制有待今后的深入研究。