肝癌肝移植预后的分子标志物研究进展

罗方舟，杨喆，郑树森，2

（1.浙江大学医学院附属第一医院 肝胆胰外科，杭州 310003；2.浙江树人学院树兰国际医学院附属树兰（杭州）医院 肝胆胰外科，杭州 310000）

肝细胞肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中占第6位，肿瘤导致的死亡率占第4位。虽然目前肝癌的发病率有所下降，但是全球范围内每年仍有约84万新发病例[1]。手术切除与肝移植是目前公认的治疗肝癌有效手段。在我国，由于庞大的乙型肝炎病毒感染人群，导致大多数肝癌患者往往伴有乙型病毒性肝炎后肝硬化的背景，部分患者无法耐受手术切除，肝移植成为了最佳选择。肝移植不仅能够彻底根治肿瘤，并且能够完全治愈肝硬化。经过长期的发展，肝移植的成功率达到60%～80%[2-3]。然而，肝移植术后肿瘤复发转移制约了肝癌肝移植患者的长期预后，符合米兰标准的受体肝移植术后肿瘤复发转移约为10%～20%。对于进展期肝癌患者肝移植，其术后1年内的肿瘤复发可达30%～60%，其5年生存率仅30%[4]。因此，早期识别肝癌复发的危险因素，筛选出高特异性、高敏感性的新型肿瘤标志物，从分子生物学层面建立肝癌肝移植术后肿瘤复发转移的早期预警体系，尽早进行临床干预以期延长患者的无瘤生存期是肝癌肝移植的主要研究方向。本文将分别从蛋白质、转录组学、传统的肿瘤标志物、肝炎病毒以及免疫学指标等方面的研究进展进行综述。

1 肝癌复发转移相关蛋白

1.1 骨桥蛋白（osteopontin，OPN）

OPN是一种钙合磷酸化的糖蛋白，广泛分布于人体内多种组织及细胞中，能够参与细胞代谢、组织修复，可促进细胞间的黏附、迁移[5]。在正常的肝脏组织中，OPN主要在胆管上皮细胞、星状细胞及Kupffer细胞中表达，并不在肝细胞中表达[6]。OPN与肝癌的复发转移关系密切，肝癌中OPN的表达水平往往与肿瘤直径、包膜侵犯、淋巴转移、肝内转移、血管侵犯以及较差的病理分型成正相关[7-9]。Kim等[10]应用ELISA法检测62例肝癌患者、60例肝硬化患者以及60例健康人群的血清OPN，发现肝癌患者的血清OPN水平明显高于肝硬化患者及健康人群，提示血清OPN是一种良好的肿瘤标志物。Sieghart等[11]回顾性分析了125例肝癌肝移植患者术后的OPN水平变化，发现OPN可以作为预测肝移植术后肿瘤复发的标志物。Ye等[12]对肝癌的基因表达研究中发现，OPN在转移性肝细胞肝癌中存在过表达，进一步动物实验发现，在高转移性肝癌裸鼠模型中，加入OPN特异性抗体能够有效抑制肝细胞肝癌肺转移，因此可推测OPN具有促进肝癌转移的能力。Pan等[8]分析了大量肝癌切除术后的肿瘤样本中的OPN mRNA表达情况，发现OPN mRNA的高表达与肿瘤直径、较晚的肿瘤分期、早期复发、偏低的10年生存率相关，OPN的高表达对肿瘤的复发转移具有较好的预警作用。因此继续研究OPN与肝癌肝移植后肿瘤的复发转移的关系具有重要的意义。

1.2 β-连环蛋白（β-catenin）

β-catenin是由CTNNB1基因编码的蛋白，具有介导细胞黏附以及信号转导的功能[13]。正常细胞中β-catenin与E-cadherin分子的胞内区域相结合，在同型细胞互相黏附中扮演重要角色。此外，β-catenin还是Wnt信号通路中的重要调节因子。β-catenin的突变与肝脏相关疾病的关系尤为密切，在肝脏炎症、肝纤维化以及肝细胞肝癌的发生中都有β-catenin的异常[14]。Huang等[15]在丙肝相关肝癌中发现，约41%的肿瘤组织中可以检测到β-catenin基因的突变，并且在所有的β-catenin基因突变肝癌组织中均可检测到β-catenin蛋白在细胞核内的异常聚集，据此推测肝癌细胞中β-catenin的激活可能是肿瘤发生的重要因素之一。另外，还有许多研究显示，各种方式诱导的动物肝癌模型中β-catenin均有异常聚集[16-17]。Fiorentino等[18]对83例肝癌肝移植患者进行术后随访发现，β-catenin的表达与患者术后的复发转移密切相关，并且β-catenin可作为独立预测移植术后肿瘤复发的独立危险因子。β-catenin除了可以通过Wnt通路导致细胞的恶性转化外，还可以通过影响细胞间的黏附促进肿瘤的转移。Endo等[19]发现对比肝癌与癌旁组织，β-catenin高表达与E-cadherin的低表达密切相关，且β-catenin的高表达与血管侵犯密切相关，提示我们β-catenin可能通过与E-cadherin的作用促进肝癌血管侵犯进而促进肿瘤转移。在肝癌肝移植领域中，从信号转导以及临床预后分析角度来看，β-catenin可作为病肝的检验指标用以指导患者术后的治疗方案。

1.3 高尔基体蛋白-73（Glycoprotein 73，GP-73）

GP-73是一种位于高尔基体顺面的磷酸化跨膜蛋白，由Kladney等[20]发现，由于其在SDS-PAGE中显示相对分子量为73 kD，且定位于高尔基体上，故命名为高尔基体蛋白-73。在肝脏中，GP-73主要表达于胆管上皮细胞，很少表达于肝细胞中，在肝脏病变的情况下导致GP-73被切割并释放入血，因此血清GP-73升高提示肝脏受损。在肝癌组织中，GP-73被发现较癌旁组织明显升高[21]。Wei等[22]对比了肝癌组患者、肝硬化组患者、慢性肝炎组患者以及健康人群中血清GP-73的含量，与健康人群的标本相比肝癌组的相对值为17.15，肝硬化组的相对值为5.69，慢性肝炎组患者为3.01，差异显著。Marrero等[23]亦发现肝癌患者的血清GP-73水平要明显高于肝硬化患者，GP-73的诊断肝癌的特异度和灵敏度分别为75%、69%。在AFP阴性的肝癌患者中，约有53%的肝癌患者GP-73明显升高，说明其对早期肝癌的诊断具有十分重要的意义。Zhang等[24]发现GP-73与肿瘤的增殖具有联系，在干扰GP-73的表达后肝癌细胞系HepG2与BEL-7402的增殖率大幅下降，可达到约50%。但是在另外两项实验中敲低GP-73的表达后，肝癌细胞系的增殖率下降趋势并不明显[25-26]。因此GP-73与肝癌细胞的增殖方面仍需进一步的探究。

1.4 α-L-岩藻糖苷酶（alpha-L-fucosidase，AFU）

AFU是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体的组织细胞当中，以肝、肾分布最为广泛，在机体中主要起催化分解含岩藻糖基的糖蛋白、糖苷作用。AFU作为肝癌的肿瘤标志物是首先由Morris等在小鼠实验中发现的，他们发现在小鼠的肝癌组织样本中，AFU的活性较正常肝脏组织高了近7倍，且与肿瘤的生长相关。之后法国学者Deugnier等[27]在3例肝癌患者的血清中发现AFU明显升高，并提出可将AFU作为肝癌诊断的生物学标志物。自AFU被发现与肝癌相关以来，各种研究层出不穷。有国内研究显示血清AFU对肝癌的诊断阳性率在64%～84%之间，特异度在90%，且患者血清的AFU变化与AFP无明显的相关性[28]。Frawzy等[29]分别对比了肝癌患者、肝硬化患者以及健康对照人群的血清AFU水平，发现肝癌患者的AFU水平要明显高于其它两组。Wang等[30]通过回顾性分析669例肝癌患者的病理学资料与临床资料发现，AFU可以作为一个独立的预后预测因子，患者术前AFU＞35 U/L的患者术后肝癌更容易复发。因此AFU作为预测肝癌肝移植术后肿瘤复发方面具有一定的价值。

2 肝癌复发转移的转录组学研究进展

2.1 微小RNA（microRNA，miRNA）

miRNA是指一类长度约为19～25 nt没有编译功能的单链RNA，miRNA可在转录后水平调控基因的表达，通过碱基互补配对与相应的靶mRNA结合，诱导其剪切或抑制其翻译[31]。miRNA在肿瘤的研究中占有重要的地位，大量的研究揭示miRNA在肿瘤的发生、发展以及复发转移中占有重要的地位。miRNA可作为许多肿瘤的潜在生物学标志物，如前列腺癌、肺癌、胃癌等[32-34]。在肝癌的研究中，大量的miRNA被报道。如miR-125b-5p与miR-15b-5p被发现与细胞的恶性增殖有关，且早期便在肝癌血清样本中高表达，可作为早期诊断肝癌的标志物[35]。再者，如miR-101-3p、miR-224-5p以及miR-483-5p被发现与肿瘤细胞抵抗凋亡有关，miR-101-3p在肝癌组织中显著降低，而miR-224-5p和miR-483-5p则被发现明显上调[36-38]。Peng等[39-40]在肝癌肝移植患者的组织样本中发现miR-203与miR-155与患者的预后显著相关，miR-203在术后复发的肝癌组织中表达量要明显低于无复发的肝癌组织，结合患者的预后分析发现，miR-203高表达的移植受体术后的无瘤生存期与总体生存率明显高于低表达组的患者；另外，miR-155被发现在复发的肝癌组织样本中表达量要明显高于无复发的肝癌组织样本，且高表达miR-155的受者预后明显不如低表达组。Yang等[41]发现miR-26a-5p在肝癌组织中低表达，其生物学功能可通过HGF-cMet通路抑制肿瘤血管的形成，可作为移植术后患者的预后评判指标。miRNA在肝癌的研究中还有许多尚未被挖掘，目前为止大多数的研究距离实际应用仍有较长的路要走，对miRNA的调控肿瘤方式研究较为广泛，然而尚未发现某个miRNA具有实际的临床应用价值，还需要更多的临床样本进行进一步的探究。

2.2 长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）

lncRNA是指一类长度超过200 nt的非编码RNA，其自身并不编码蛋白质，在很长一段时间里被认为是转录的废物，没有生物学功能。近年来研究显示，lncRNA在表观遗传调控、细胞分化与细胞周期的调控中起重要作用，可通过调节基因表达从而影响细胞的生命活动[42]。随着肿瘤研究的深入，lncRNA同样在肿瘤的调控中扮演极其重要的角色，因而lncRNA也可以作为潜在的肿瘤分子标志物。Konish等[43]研究发现lncRNA MALAT-1的血清浓度与肝脏损伤相关，可以提示肝癌的发生。同时Yang等[44-45]阐明lncRNA MALAT-1与HOTAIR通过影响肝癌细胞的增殖、凋亡，增加侵袭性与转移能力从而促进肿瘤的转移、播散，高表达MALAT-1与HOTAIR提示移植术后患者的不良预后及高危复发风险。另外，还有许多肝癌相关的lncRNA被不断发现，如H19、lncRNA-HEIH、lncRNA-HULC、TUC338等[46-48]。由此可见，lncRNA在肝癌患者的预后中占据重要地位，目前仍有许多lncRNA的作用机制尚未被阐明，lncRNA亦可作为肿瘤标志物检测肝癌肝移植术后患者的病情变化。

3 传统肿瘤标志物

3.1 甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）

AFP是目前临床上应用最为广泛的肝癌血清学标志物，属于血清白蛋白家族。正常的成年人几乎不表达AFP，正常情况下，AFP主要由胚胎的肝脏组织产生、分泌，参与许多重要的分子转运过程[49]。因此在妊娠期孕妇的血清AFP水平可有所升高，但产后会迅速下降，达到最低值。目前AFP应用于诊断肝细胞肝癌的标准为：血清浓度≥20 ng/mL为AFP阳性，提示肝癌可能；若AFP≥400 ng/mL则是确诊肝癌的重要标准之一。AFP除了应用于肝癌的诊断上，亦被应用于肝癌肝移植的受体选择上。Mazzafero等[50]于1996年提出了经典的米兰标准，即单个肿瘤直径不超过5 cm；或肿瘤总数不超过3个，最大直径小于3 cm，无血管侵犯，无淋巴转移以及肝外转移。符合米兰标准的患者肝移植后取得了良好的预后，4年无瘤生存率可达到92%。然而米兰标准对受体的选择过于苛刻，导致许多患者失去肝移植手术的机会。为进一步扩大移植受体的范围，Yao等[51]于2001年提出了UCSF标准，将单个最大肿瘤直径扩大为6.5 cm，多发最大肿瘤直径扩大到4.5 cm，扩展了肝癌肝移植的受体人群，且长期预后与米兰标准相比并无明显差异。米兰标准与UCSF标准对肝癌肝移植具有重大的意义，但是它们均局限在肿瘤的大小与数目上，没有考虑肝癌的生物学特性。我们团队于2006年提出了适合国情的杭州标准，即肝癌累计直径小于8 cm，或者肿瘤总直径超过8 cm，但是血清AFP水平≤400 ng/mL，且病理学分级为中高分化者也可行肝移植。杭州标准的提出显著增加了肝移植的受益人群，且术后3年存活率达到70.7%，与米兰标准相比无明显差异。AFP除了可应用与肝癌肝移植术前受体选择上，亦可应用于患者肝移植术后的肿瘤复发转移动态监测中。Nörthen等[52]通过回顾性分析63例肝癌肝移植患者的预后，发现术后1、3、5年的AFP分别超过7、6、6 μg/L提示患者术后不良预后，具有预警术后肝癌复发作用。我们团队通过分析本中心肝癌肝移植患者的AFP与18F最大吸收值，发现术后3个月、半年AFP≤1 000 ng/mL以及SUVmax＜5的患者预后较其他高AFP及SUVmax组的患者预后更好，1年生存率可达73.3%，提示AFP结合其他检查结果可以成为很好的术后预测肝癌复发转移指标。

3.2 脱-γ-羧基凝血酶原（des-γ-carboxy prothrombin，DCP）

DCP是一种异常的凝血酶原，最先由Liebman等[53]于1984年报道，相比于正常的凝血酶原，DCP中一个或多个谷氨酸的残基不能被羧基化，导致DCP无法与钙离子相结合，因而无法发挥正常的凝血功能。Inagaki等[54]发现在肝癌的患者中，DCP的血清浓度明显与肿瘤的分期、病灶的大小、门脉有无癌栓形成等密切相关。日本学者在活体肝移植中发现，肝癌肝移植患者术前DCP＞400 mAU/mL是患者术后肿瘤复发的独立危险因素[55]。据此，Ito等[56]将DCP纳入肝癌肝移植受体的选择标准中，并提出了肝癌肝移植京都标准，即肿瘤数量≤10个，肿瘤直径≤5 cm，血清DCP≤400 mAU/mL。多项研究显示DCP在肝癌患者的血清及组织中特异性表达，Marrero等[57]通过分析西方人群研究发现DCP在鉴别肝癌与肝硬化、慢性肝炎的特异性与敏感性分别为95%和89%。国内付水等[58]通过对肝癌患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者以及健康人群的血清DCP与AFP对比研究发现DCP诊断肝癌的特异度与敏感度分别为89.57%与77.36%，而AFP的特异度与敏感度分别为77.91%与60.38%。由此可见DCP在鉴别诊断肝癌、肝硬化以及慢性肝炎具有更高的价值。当然亦有研究认为DCP的临床诊断价值有限，对早期肝癌的诊断敏感度仅为56%[59]。DCP除了在诊断肝癌方面具有价值外，亦有研究指出DCP具有促进肿瘤发展、转移的作用。Gao等[60]通过体外实验与小鼠实验发现DCP具有促进肝癌细胞VEGF、TGF-α、bFGF的表达水平，在小鼠实验中发现DCP具有促进肿瘤组织恶性增殖的能力，并且能够增加肿瘤组织的微血管密度。由此可见DCP亦可作为肝癌治疗的靶点。我们团队通过对肝移植术后患者的血清学检查分析发现，术后3个月DCP与AFP均为阴性的患者术后总生存率最高，DCP与AFP均阳性的患者术后总体生存率最低，AFP与DCP单个血清学指标阳性的患者生存率居中。由此可见，无论是在术前肝移植受体的选择还是术后肿瘤复发、转移的监测，甚至是肝癌治疗方面，DCP都具有极高的价值，是良好的预警指标。

4 免疫-炎症-肿瘤相关生物学标志物

近年来，随着程序性死亡受体-1及其配体（programmed death protein-1/ligand1，PD-1/L1）与肿瘤的发生发展机制被不断的阐明，肿瘤的免疫疗法不断的兴起，肿瘤免疫学成为了一个极具发展潜力的领域。PD-1/L1是CD28/B7超家族的新成员，具有负性调节免疫相关细胞的作用，PD-1分子可在活化的T、B细胞以及巨噬细胞表面高表达，而在肿瘤组织中，PD-1的高表达可使淋巴细胞的肿瘤杀伤能力降低，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸[61-62]。随着对肿瘤免疫的研究深入，可溶性PD-1（sPD-1）被发现，并被证明其与肿瘤的发生发展有密切的联系。然而，关于sPD-1的产生、表达的特征以及作用机制目前报道很少。Nielsen等[63]在活化的T细胞中发现了多种PD-1的mRNA剪接变异体，发现了一种缺失编码PD-1分子的跨膜区的mRNA，推测其可能与sPD-1的产生有关。Zhu等[64]利用sPD-1的ELISA试剂盒分别对肝癌患者、慢性乙肝感染患者、乙肝肝硬化患者以及健康对照人群的外周血样本进行检测，发现肝癌患者外周血的sPD-1明显低于肝硬化患者、慢性乙肝感染患者，且外周血的sPD-1水平与肿瘤的分期呈负相关。Onlamoon等[65]在动物实验中通过基因工程使sPD-1蛋白与PD-L1相结合，发现sPD-1可以封闭肿瘤细胞表面的PD-L1，从而避免了淋巴细胞的耗竭。由此可见，分泌型的PD-1可以反应机体对肿瘤细胞的免疫状态，具有很好的预测肿瘤复发转移的免疫分子的前景。

炎症在肿瘤的发生发展过程中已被广泛研究，已有研究显示慢性炎症与肿瘤的复发转移密切相关[66]。外周血的中性粒细胞与淋巴细胞的比值能够很好的反应机体的炎症与免疫状态。研究显示中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil and lymphocyte ratio，NLR）的截断值为5，与结直肠癌、肝癌的肿瘤的术后复发转移密切相关，患者术后NLR≥5往往提示不良的预后[67-68]。肝癌肝移植中，Halazun等[69]分析了150例肝移植受体术前的NLR，发现术前高NLR（≥5）的患者移植术后肝癌复发的风险比低NLR组患者明显升高，且在米兰标准内，高NLR患者的预后较低NLR患者的预后较差。可见NLR这一容易获取的指标具有很好的预测作用。Chen等[70]根据101例乙肝相关肝癌肝移植患者的术前NLR进行研究分析发现NLR≥3的受者人群术后肝癌转移复发率更高，认为NLR≥3是判断患者整体慢性炎症的截断值。针对患者移植术后肿瘤复发的检测，我们团队回顾分析了100余例肝癌肝移植患者，发现术后AFP与NLR联用能够很好的预测患者的长期预后，并发现术后3个月患者的NLR≥7提示患者的不良预后。NLR在预测肝移植术后的复发转移中仍有较大的探索空间，对于NLR的cut-off值仍需进一步多中心、大样本的研究、探索。

5 乙型肝炎病毒感染

在我国，由于乙型肝炎病毒的广泛流行，大部分肝癌患者都有乙型肝炎病毒感染的背景，乙型肝炎病毒感染相关肝癌约占所有肝癌的70%～85%[71-72]。因此明确乙型肝炎病毒与移植后肿瘤复发的关系显得尤为重要。已有研究表明，肝移植术后高乙型肝炎病毒负荷是术后肿瘤复发的高危因素。Campsen等[73]研究发现肝癌肝移植术后乙型肝炎病毒再感染的人群肿瘤复发是未感染人群的3.6倍，术后积极抗病毒治疗，预防乙型肝炎病毒再感染能够有效地延长患者的无瘤生存期。由此可见，术后乙型肝炎病毒再感染以及高负荷的乙型肝炎病毒载量是患者移植术后肿瘤复发的危险因素。因此应当将抗病毒治疗及检测纳入肝癌肝移植的常规治疗措施中。

6 展望

随着我国肝移植事业的不断发展，越来越多的难以手术切除病灶的肝癌患者获得根治性治疗的机会。然而，肝癌肝移植术后肝癌复发仍然是制约术后患者长期生存的主要影响因素。随着越来越多的分子标志物被发现，早期预测肝移植后肝癌的复发逐渐成为可能，大量的研究聚焦于建议预测肝移植术后肝癌复发模型上，并且取得了巨大的进步。但是，目前预测肝癌肝移植术后复发的分子标志物研究仍大多停留于实验室阶段，不足以指导临床的诊治工作。当前的主要工作是进一步寻找新型的预测肝癌复发转移的分子标志物，将现有的分子标志物进行多中心、大规模临床验证，建立肝移植术后肝癌复发转移的预警体系，对高风险患者进行及时干预，以期延长患者术后的生存期，使患者达到长期存活。