紫苏叶黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

(金华职业技术学院 农业与生物工程学院，浙江 金华 321000)

油脂中的不饱和脂肪酸在氧、日光、微生物、酶等作用下会被氧化而酸败变质[1]。在氧化过程中会产生自由基、氢过氧化物及醛和酮等化合物，使油脂本身的营养成分遭到破坏从而丧失营养价值[2-3]。除了采用低温避光、油脂精炼等方法延缓油脂及含油食品氧化酸败，添加抗氧化剂是防止和延缓油脂氧化劣变的最行之有效的方法[4]。传统的抗氧化剂包括TBHQ，BHA，BHT和PG等，都是合成抗氧化剂[5]。实验表明：合成抗氧化剂对动物体有危害，如BHA对白鼠有致癌作用、BHT可引起动物肝脏增大，现已限制或停止使用[6]。天然抗氧化剂由于高效无毒、安全性高，已成为食品添加剂研究领域的重点，也是食品科学领域的一个发展趋势[7]。

紫苏(PerillafrutescensL.)，唇形科紫苏属，一年生草本植物，具有特异芳香气味[8]，含有多种活性成分[9]，是我国首批公布的药食两用中草药资源之一。紫苏叶含有的黄酮类物质是一类多功能的天然活性物质，具有抗氧化、抑菌、调节血脂和提高免疫力等功能，在抗癌和抗衰老方面能起到重要作用[10]。目前国内对紫苏叶的研究主要集中在紫苏叶黄酮提取、降血糖和抗炎等方面[11]，对紫苏叶黄酮在油脂中抗氧化的研究报道较少。笔者通过微波辅助提取紫苏叶中黄酮类物质，采用响应面法优化提取工艺，以大豆油为研究对象，考察紫苏叶黄酮对高温下油脂的抗氧化作用，为深入研究和开发紫苏的价值及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫苏叶，浙江江山世紫生物科技公司；AR1140电子分析天平，奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；HH-2恒温水浴锅，江苏省金坛市江南仪器厂；R206B可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；722E旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮含量测定

以芦丁为标样，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定紫苏提取物中总黄酮含量[12]。标准曲线的回归方程为

y=0.951 8x+0.031 1

式中：y为吸光度；x为芦丁质量浓度，单位为mg/mL；相关系数为R2=0.997 6。

1.2.2 单因素实验

取20 g干燥紫苏叶(粉碎过100目筛)，按照一定的料液比加入体积分数为80%的乙醇溶液，然后设定微波功率和提取时间，提取完成后，离心10 min，测定上清液中黄酮含量。

以黄酮提取量为指标进行单因素实验。1) 考察微波功率的影响，料液比为m(紫苏叶)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，微波功率分别设置为200，300，400，500，600 W，提取时间为30 min；2) 考察料液比的影响，料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)分别为1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，1∶1，1∶16 g/mL，微波功率为300 W，提取时间为30 min；3) 考察提取时间的影响，料液比为m(紫苏叶)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，微波功率为300 W，提取时间分别为20，25，30，35，40 min。

1.2.3 优化实验

根据单因素实验结果，选择微波功率、料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)和提取时间为实验因素，以黄酮提取量为响应值，利用Design-Expert 8.5软件对紫苏叶中黄酮微波提取工艺参数进行设计，实验设计见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 紫苏叶黄酮对高温下大豆油品质的影响

由于紫苏叶黄酮较难溶于油脂，需添加助溶剂以增加其在油脂中的溶解度，选择聚乙二醇作为助溶剂。称取0.5 g紫苏叶黄酮，加入聚乙二醇5 mL，混匀，加入大豆油中，在烧杯中配置紫苏叶黄酮的质量分数分别为0，0.1%，0.3%和0.5%的大豆油各50 g，置于180 ℃(模拟食用油煎炸温度)的烘箱正中央，每隔一定时间测定油样的酸价、过氧化值、p-茴香胺值和维生素E含量，计算全氧化值，进而衡量高温下紫苏叶黄酮对大豆油的抗氧化性。

大豆油酸价和过氧化值参照GB/T 5538—2005进行测定，p-茴香胺值按GB/T 24304—2009进行测定。全氧化值(TV)是评价油脂整体氧化程度的指标，计算公式为

TV=4PV+p-AnV

式中：PV为油样过氧化值；p-AnV为油样p-茴香胺值。

1.3 数据处理

所有实验平行测定3次，使用方差分析。样品间的差异采用SPSS 16.0 Duncan法进行显著性分析，显著水平为0.05。

2 结果与讨论

2.1 单因素及其实验结果

2.1.1 微波功率对紫苏叶中黄酮提取的影响

微波功率对紫苏叶中黄酮的提取效果的影响见图1(a)。由图1(a)可知：细胞膜上的分子在微波作用下产生瞬时极化，增加分子键的振动、撕裂和粒子之间的摩擦与碰撞，进而使得细胞膜破裂，细胞液中的活性物质扩散到溶剂中[13]。随着微波功率的增加，分子运动越剧烈，黄酮提取量也越大。当微波功率过大时，可能导致活性物质间产生副作用，使提取率下降，因此，紫苏叶中黄酮提取的最佳微波功率为400 W。

2.1.2 料液比对紫苏叶中黄酮提取的影响

料液比对紫苏叶中黄酮的提取效果的影响见图1(b)。由图1(b)可知：当料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)为1∶8～1∶12 g/mL时，紫苏叶中黄酮提取量随着料液比的增加而增加，低于1∶12 g/mL后，黄酮提取量趋于平缓甚至会减少。在溶剂乙醇相对低的时候，紫苏叶无法完全浸润，适当增加溶剂，使得紫苏叶细胞内外浓度梯度扩大，传质动力提高，黄酮提取量随之增加，因此选择料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)分别为1∶10，1∶12，1∶14 g/mL做进一步研究。

2.1.3 提取时间对紫苏叶中黄酮提取的影响

提取时间对紫苏叶中黄酮提取的影响见图1(c)。由图1(c)可知：随着提取时间的增加，紫苏叶中黄酮提取量先增加后减少，提取时间为35 min时，提取量最大。这是因为随着时间的延长，由于微波的作用，使得细胞破裂，提取率升高。当提取时间达到一定值后，有效成分大部分扩散出来，溶液内部达到一定的平衡，延长提取时间对提取量的增加没有效果，因此选择提取时间为30，35，40 min做进一步研究。

图1 紫苏叶黄酮提取单因素实验Fig.1 Single factor experiment on flavonoids extraction from Folium perillae

2.2 响应面实验结果分析

根据单因素实验结果，选择微波功率(A)、料液比(B)和提取时间(C)为考察因素，以紫苏叶中黄酮提取量为考察指标，使用Design-Expert 8.5程序辅助设计Box-Behnken三因素三水平优化实验[14]。实验共有17个实验点，包括12个响应实验和5个中心实验。响应面分析方案及结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.1 回归模型有效性及显著性分析

按照表2响应面的结果用Design-Expert 8.5软件实施回归拟合分析，并对回归模型进行方差分析，结果如表3所示。经回归拟合得到微波功率、料液比和提取时间对黄酮提取量(Y)影响的二次多项回归模型为

Y=7.00+0.42A+0.23B+0.51C-0.15AB+

0.18AC-0.25BC+1.7BD-0.82A2-

0.356B2-0.52C2

表3 响应面二次模型方差分析

对回归模型进行方差分析，模型的p值小于0.000 1，极显著，失拟项p值大于0.05，不显著，表明该模型拟合度好，实验误差小，结果切合实际[15]。因此，可利用该模型对紫苏叶黄酮提取的最佳工艺条件进行分析。由表3中p值可知：微波功率、料液比和提取时间对黄酮提取量的影响达极显著水平(p<0.01)，且料液比与提取时间的交互作用达到了极显著的水平。另外，由F值可知对紫苏叶中黄酮提取影响大小的排列顺序为：微波功率>提取时间>料液比。

2.2.2 响应面分析结果

根据回归方程，绘出响应面分析图和等高线图，见图2。从图中可直观地看出各因素对紫苏叶中黄酮提取量的影响，响应面的最高点所对应的影响因素取值可以判定为最佳条件。另外，两因素间交互作用越显著，其等高线图形越接近于椭圆形，反之，越接近于圆形[16]。

通过对回归方程求解，得出对紫苏叶中黄酮提取的最优条件为微波功率430.61 W，料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)=1∶12.14 g/mL，提取时间32.65 min，理论黄酮提取质量分数为7.20 mg/g。综合实际条件，将提取工艺调整为微波功率430 W，料液比1∶12 g/mL，提取时间32 min，此条件下，黄酮的提取质量分数为7.18 mg/g，与预测值基本吻合，说明该优化模型准确可靠，能够为改善紫苏叶黄酮提取工艺提供指导与帮助。

2.3 紫苏叶黄酮对大豆油品质的影响

过氧化值是衡量油脂氧化初期形成的氢过氧化物含量的一个重要指标，但氢过氧化物性质不稳定，高温下易分解为醛、醇和酮等物质，因此，过氧化值是氢过氧化物生成和分解的综合结果[17]。紫苏叶黄酮有一定的抗氧化作用，不同添加量的紫苏叶黄酮对过氧化值的影响见图3(a)。由图可知：随着加热时间的延长，添加紫苏叶黄酮的大豆油和空白对照组油样的过氧化值均呈先升高后平缓的趋势；加热的前2 h内过氧化值升高趋势明显，此时氢过氧化物处于大量生成中；继续加热，大豆油的过氧化值趋于平缓，可能是在此过程中氢过氧化物处于生成和分解的平衡点上。添加了紫苏叶黄酮的大豆油，其过氧化值均低于空白组，并且随着紫苏叶黄酮添加量的增加，其过氧化值越小，这主要是由于紫苏黄酮在加热过程中可提供活泼氢，进而参与到大豆油初级氧化的自由基链式反应中，起到了一定的抗氧化作用。由此可知，紫苏叶黄酮对大豆油煎炸过程中过氧化值的升高具有微弱的抑制作用。

酸价反映的是油脂中游离脂肪酸含量的多少，是判断食用植物油品质的有效指标。油脂的酸价越高就越容易发生氧化酸败，不同添加量的紫苏叶黄酮对酸价的影响见图3(b)。由图可知：随着加热时间的延长，添加紫苏叶黄酮的大豆油和空白油样的酸价都有所增加。大豆油酸价升高主要是由于在加热过程中大豆油中甘油三酯的断裂及不饱和甘油三酯氧化生成的氢过氧化物都会分解生成一些小分子的酸[18]。从图中也可看出：各个加热时间段，添加紫苏叶黄酮的大豆油样酸价与空白油样酸价相差非常微小，说明在加热过程中紫苏叶黄酮对大豆油酸价的升高几乎没有抑制作用。

p-茴香胺值反映的是油脂氧化产生的二次氧化产物中无挥发性的α-或β-不饱和醛类的含量，与油脂的酸败程度密切相关[19]，不同添加量的紫苏叶黄酮对p-茴香胺值的影响见图3(c)。由图可知：随着煎炸时间的延长，添加紫苏叶黄酮的大豆油和空白油样的p-茴香胺值均呈逐渐上升趋势，并且添加紫苏叶黄酮的大豆油的p-茴香胺值小于空白对照，与空白样品相比，添加0.5%紫苏叶黄酮样品的p-茴香胺值少了26.4%。由此可知，紫苏叶黄酮对煎炸大豆油次级氧化产物的形成具有一定的抑制效果。

全氧化值是衡量油脂整体氧化程度的指标[20]，不同添加量的紫苏叶黄酮对全氧化值的影响见图3(d)。由图可知：紫苏叶黄酮对大豆油加热的p-茴香胺值和全氧化值的增加具有一定的抑制作用，且随添加量的增加，抑制作用增强。实验表明：添加了紫苏叶黄酮的大豆油在高温加热条件下的抗氧化性能较好，其效果随着添加量的增加而增强。

图3 不同添加量的紫苏叶黄酮对大豆油的品质的影响Fig.3 Effect of different addictive amount of Folium perillae flavone on soybean oil

3 结 论

笔者采用微波辅助乙醇提取紫苏叶中的黄酮，在单因素实验基础上，通过响应面Box-Benhnken实验设计，建立紫苏叶黄酮得率的二次多项回归模型，优化出微波辅助提取紫苏叶黄酮的佳工艺条件为：微波功率430 W，料液比m(紫苏叶)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，提取时间32 min，此条件下，黄酮的提取质量分数为7.184 mg/g，与理论值相接近，表明该模型可以较好地预测紫苏叶黄酮的微波辅助提取得率。另外，紫苏叶黄酮有较强的抗氧化作用，能显著降低高温下大豆油的过氧化值、p-茴香胺值和全氧化值，且效果随着添加量的增加而增强，与空白样品相比，添加0.5%紫苏叶黄酮的样品的p-茴香胺值少了26.4%，但对抑制大豆油加热过程中酸价的增加不显著。紫苏叶黄酮对大豆油良好的保护效果表明其适合作为高温烘烤含油食品的抗氧化添加剂。