有机氮源及其在微生物发酵中的应用

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(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.天津科技大学 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

生物体的生存离不开环境中的营养物质，微生物也不例外，只有在营养条件适宜的条件下，微生物才能顺利地生长繁殖。微生物生长离不开碳源、氮源、无机盐、生长因子和水等五大营养因素[1]。氮源的主要作用是维持胞内需氮化合物的合成，比如氨基酸、蛋白质和核酸等。氮源按物质性质的不同分为两大类：无机氮源和有机氮源。因无机氮源发挥作用快，可迅速被细胞分解吸收，称为速效氮源，可满足微生物生长初期的氮源需求，包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等[2]。有机氮源包括蛋白胨、玉米浆和各种有机粉饼等物质，如酵母浸粉、花生饼粉、黄豆饼粉和棉子饼粉等[3]。有机氮源含有丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可以直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用[4]，维生素可以作为一些酶的辅因子参加胞内生命活动，只有某些微生物可以利用嘌呤和嘧啶，如尿素发酵梭菌[5]。有机氮源只有被细胞水解后才会发挥作用，水解过程比较缓慢，细胞对蛋白的利用速度也比较慢，所以这类氮源常被称为迟效氮源[2]。在微生物培养过程中，无机氮源与有机氮源总是相互配合发挥作用。按一定比例将二者加入培养基中，无机氮源可满足前期微生物的快速生长，有机氮源则可以满足微生物中后期生长及产物积累。

1 几种常用的有机氮源

酵母粉分为天然酵母粉和酵母浸粉，天然酵母粉主要由多种酵母菌自然繁殖而成，因酵母菌大部分附着在果实、谷物和花上，所以天然酵母粉的营养物质主要由附着物决定，是一种纯天然、无污染的健康营养源[6]。酵母浸粉是由人工制备的酵母粉，是在一定条件下，将面包酵母或啤酒酵母自溶和酶法破壁，将蛋白质、矿物质等营养物质充分释放、降解，最后经浓缩或干燥制成的更容易被吸收的膏状或粉状物质[7]。

蛋白胨，由多种氨基酸和多肽构成，制作原料主要是肉、酪素或明胶等，是利用生物手段将原料水解后浓缩干燥而成的一种浅黄色粉末。从来源分，蛋白胨可分为动物性蛋白胨、植物性蛋白胨和微生物蛋白胨。动物性蛋白胨包括胰胨、肉胨和骨胨等，大豆蛋白胨属于植物性蛋白胨，酵母蛋白胨属于微生物蛋白胨。蛋白胨含有丰富的营养物质，被视为微生物生长必不可少的营养物质，已广泛应用于医药、微生物发酵和科研等领域，因不同生物体生长所需的氨基酸与多肽等营养物质不同，每种蛋白胨所含的营养物质也有差别，因此科学使用蛋白胨也是一门技术。

与酵母浸出物、蛋白胨和豆粕水解液等有机氮源相比，玉米浆可被视为最廉价的有机氮源。玉米浆是湿磨法生产玉米淀粉的副产物，富含糖类、可溶性蛋白质、氨基酸和多肽等营养物质[8]，其氨基酸、维生素和生长因子的种类和含量明显高于酵母浸出物及蛋白胨，不仅有利于菌体生长，还可以提高发酵产酸和糖酸转化率。

2 常用有机氮源及其应用

氮源的来源和批次不同，其成分会有一定的差异，对微生物发酵及产酸都有影响。因此，对氮源进行筛选时，将原料来源及生产厂家资质视为严格把关的环节，对提高生产水平，降低生产成本具有指导意义[5]。

腺嘌呤是酵母浸粉成分之一，肌苷合成需要大量腺嘌呤，因此在肌苷合成过程中，酵母浸粉被视为腺嘌呤供体，对细胞生长及肌酐合成均有一定的正向或负向影响。吴敏芝等[9]探索了一系列浓度梯度的酵母浸粉的添加对肌苷积累的影响，从而确定酵母浸粉添加量为1.6%～1.8%时，最有利于肌苷的积累，过高或过低对肌苷的积累都是不利的。李建国等[10]在利用枯草芽孢杆菌生产核黄素的研究中，探索了酵母浸粉对核黄素积累的影响，适量的酵母浸粉可为核黄素的积累提供氮源及生长因子，酵母浸粉中某些可溶性组分的过量存在，会造成碳流阻滞，降低核黄素的合成速率和产量。

蛋白胨种类繁多，每种蛋白胨中含有的营养成分会有所差别，每种微生物所需的营养源也不尽相同，因此为特定的菌种寻找最适的蛋白胨来满足细胞生长显得尤为重要。邱玉棠等[11]在以枯草芽孢杆菌积累肌苷的研究中，选择了两种来源不同的蛋白胨添加入培养基中，结果表明，两类蛋白胨在细胞形态和肌苷积累等方向的效果有明显差异，最终肌苷产量的差异超过8 g/L，这也足以说明合适的蛋白胨对菌种发酵有着明显的正向效果。蛋白胨是一种由月示、胨、肽和氨基酸等组成的混合物，在胞内水解后才会发挥作用，水解程度不同，得到的产物对细胞的作用也会不同。刘定杭等[12]经酶法对牛骨蛋白胨进行了不同程度的水解，得到11种蛋白胨，选择副干酪乳杆菌和产低温蛋白酶两种菌株作为测试菌株，对11种蛋白胨的作用进行研究，发现副干酪乳杆菌对蛋白胨的水解程度没有明显要求，11种蛋白胨均可以满足细胞生长需求，但是产低温蛋白酶菌株所产出蛋白质的活力与蛋白胨中小分子肽所占比例有关，比例越高，产低温蛋白酶菌株产出的目的蛋白活性越高，表明一些目的产品会受到蛋白胨中多肽分布及分子量大小的影响。

微生物发酵过程中，酵母浸粉和蛋白胨已被视为必需营养物质，为达到最佳发酵效果，两者总是会搭配使用。酵母浸粉蛋白分子与蛋白胨分子相比较小，水解物分子量介于月示和肽之间，小分子的酵母浸粉有利于菌体吸收，促进菌体生长，蛋白胨的使用则利于产物稳定期的延长，促进产物代谢，大分子蛋白质有利于刺激蛋白的表达，促进产物代谢。在以大肠杆菌生产多种氨基酸时[13-17]，培养基中酵母浸粉和蛋白胨都被视为必需成分来添加，以满足细胞生长的需求。

微生物发酵行业中利用的玉米浆仅占玉米浆生产总量的很少一部分，玉米浆生产成本低，因此扩大玉米浆在微生物发酵行业中的应用不仅可以提高玉米浆价值，也可以降低微生物发酵生产成本。但是，玉米浆成分的不稳定性是我们在利用玉米浆时必须面对的问题。生产原料工艺控制、生产季节及玉米浆的储运等因素均会造成玉米浆成分的改变，对微生物发酵产生较为明显的影响[18]。乳酸菌的培养成分复杂，需添加营养物质丰富的酵母浸粉和牛肉膏，但酵母浸粉和牛肉膏生产成本较高，增加了乳酸发酵的成本。丁涓等[19]尝试用玉米浆替代乳酸发酵培养基中的牛肉膏，以期降低生产成本。研究表明：质量浓度为41 g/L玉米浆为主要氮源时，L-乳酸产量为11 g/L，相同条件下与添加牛肉膏9.02 g/L时产酸量接近，大大降低了成本，提高了生产效率。韩洪军等[20]利用易于培养的大肠杆菌发酵积累乳酸，同时将无机盐培养基替换为以玉米浆为有机氮源、葡萄糖结晶废糖液为碳源的培养基进行发酵，最终乳酸为112 g/L左右。此外，玉米浆中含有少量磷，磷是细胞膜磷脂双分子层的基础，也是蛋白质和核酸的组成部分[18]。在多种氨基酸如谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸和丝氨酸等[21-23]发酵生产中，玉米浆被视为常用的有机氮源添加入培养基中。

3 其他有机氮源及其应用

除上述有机氮源，豆粕水解液、花生饼粉和黄豆饼粉等有机氮源在特定微生物发酵生产中也得到利用。在温敏型谷氨酸发酵工艺中，豆粕水解液作为常用有机氮源来满足发酵所需的各种氨基酸及微生素，在缬氨酸、乳酸和肌苷等发酵条件下优化有机氮源时，研究者也将豆粕水解液视为一种可选的氮源进行了研究，豆粕水可以提供丰富的营养物质且缩短发酵周期[24-25]。但是豆粕水解液价格较高，增加了谷氨酸的生产成本，现已有人研究如何利用玉米浆替换豆粕水解液，以降低生产成本。

花生饼粉为纯白无味的物质，添加入食品中可以提高食品的营养价值，还可以保持食品的原有风味，已被直接用于饲料及食品涂料。在利用微生物生产α-淀粉酶时，花生饼粉被视为最佳有机氮源，无论是利用枯草芽孢杆菌[26]还是米曲霉[27]生产α-淀粉酶，以花生饼粉为氮源得到的淀粉酶的活力最高。在培养一些真菌时，培养基中添加黄豆饼粉则有利于孢子的产生，红谷霉素[28]、抗生素AGPM[29]和灵芝菌丝体[30]发酵过程中，黄豆饼粉的添加均有利于目的产物的积累。

黄豆饼粉、棉籽、大豆浓缩蛋白和蚕蛹粉作为有机氮源供体，也应用于不同的领域，见表1。

表1 各种有机氮源的应用Table 1 Application of various organic nitrogen sources

4 结 论

随着有机氮源的发展应用，复合氮源[31]一词也应运而生，即在微生物培养过程中，人们并不是仅使用单一有机氮源，无机氮源与其他有机氮源也共同发挥作用。多种氮源按一定比例同时添加入培养基中，能更好地保证微生物的顺利生长及目的产物的积累。但是复合氮源的添加配比也需要在实验中摸索，以得到最佳配比。选择有机氮源时，需要考虑每种氮源和所用微生物的特性，选择合适的氮源，避免因营养源缺乏造成微生物生长受限和有机氮源的浪费。与动物和植物有机氮源相比，面包酵母类氮源经纯培养而来，含有的蛋白稳定性更高。酵母类和一些植物类有机氮源，生长因子较为丰富。有些有机氮源，比如豆粕水解液，生产中要经过高温、酸解等过程，使得大量生长因子流失。玉米浆和酵母类有机氮源含量较高，牛骨蛋白胨和胰蛋白胨等含量较低。 有机氮源与微生物发酵有着密不可分的联系，深入研究有机氮源的组分及其对微生物发酵的作用机制，对以后理性使用有机氮源有着深远意义。