酵母浸粉对枯草芽孢杆菌发酵生产尿苷的影响

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(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

尿苷广泛应用于食品、保健品、化妆品和医药行业，特别是作为医药中间体生产一些抗病毒、抗肿瘤药物，如碘苷、溴苷和氟苷等，能够阻断各种癌细胞和病毒的基因合成，治疗癌症或由病毒引起的疾病[1-2]。随着抗病毒和抗肿瘤药物的深入研发，市场对尿苷的需求量大幅上升，迫切需要成本低且能够大规模生产的尿苷生产工艺[3]。目前，工业上主要是以D-核糖和尿嘧啶为原料，采用化学合成的方法制备尿苷，该法原料价格昂贵，生产成本高[4-5]。价格低廉，环境友好，工艺相对简单的发酵法是公认的生产尿苷的理想方法，也是当前尿苷研究的主流方向[6]。本实验室在前期的研究工作中获得了一株可以高产尿苷的枯草芽孢杆菌F126[7]。本研究对枯草芽孢杆菌F126发酵产尿苷的培养基进行了优化，通过PB实验方法确定培养基中影响F126尿苷产量的最显著因素是酵母浸粉，对来源于不同厂家、不同型号的酵母粉产品进行筛选，并对所筛酵母粉的使用量和使用方法进行了优化。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌种：枯草芽孢杆菌F126，天津科技大学生物工程学院代谢工程研究室保存。

斜面培养基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，琼脂20 g/L。灭菌条件为121 ℃，20 min。

种子培养基：葡萄糖25 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO42 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L。葡萄糖单独灭菌，灭菌条件为115 ℃，15 min;其余组分灭菌条件为121 ℃，20 min。

初始发酵培养基：葡萄糖80 g/L，豆粕水解液30 mL/L，玉米浆20 mL/L，酵母浸粉15 g/L，谷氨酸钠10 g/L，尿素5 g/L，MgSO4·7H2O 8 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO42 g/L，KH2PO41 g/L。其中葡萄糖和玉米浆单独灭菌，葡萄糖灭菌条件为115 ℃，15 min;玉米浆灭菌条件为121 ℃，20 min;其余组分灭菌条件为115 ℃，15 min。

1.2 仪器与设备

所用5 L发酵罐购自上海保兴生物工程设备有限公司；所用高效液相色谱仪为Agilent 1200，购自美国安捷伦科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 斜面培养

用接种环接种1环从-80 ℃取出的冻存菌液，均匀划线于斜面培养基上，37 ℃培养12 h，并传代一次。

1.3.2 种子培养

用接种环刮取1环斜面种子接种于装有30 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，9层纱布封口，37 ℃，200 r/min振荡培养10 h。

1.3.3 摇瓶发酵

吸取3 mL种子液接种于装有27 mL发酵培养基的500 mL挡板三角瓶中，9层纱布封口，37 ℃，200 r/min振荡培养72 h，发酵过程中补加质量浓度为800 g/L的灭菌后的葡萄糖溶液，以维持发酵液中葡萄糖质量浓度在5～80 g/L。

1.3.4 5 L发酵罐发酵

将种子液按照V(种子液)∶V(发酵定容)=15∶100的接种量接种至灭菌的发酵培养基中，总体积为3 L。培养温度37 ℃，自动流加氨水，控制发酵罐内混合物pH在7.0左右，通过调节转速和通风量，控制相对溶氧在20%～30%，过程中流加800 g/L葡萄糖溶液，维持葡萄糖质量浓度在1～3 g/L。

1.3.5 分析方法

生物量通过分光光度计测量菌液在600 nm下的吸光度OD600来表征；葡萄糖浓度采用SBA-40C生物传感仪测定。

采用高效液相色谱法测定发酵液中尿苷的浓度，色谱柱为Phenomenex Gemini 5u C18110A 150 mm×4.6 mm，柱温30 ℃，流动相为V(乙腈)∶V(水)=2∶98，流速1 mL/min，每个样品进样20 μL，紫外检测波长270 nm，分析时间12 min。

2 结果与讨论

2.1 PB实验确定影响尿苷产量的显著因素

Plackett-Burman(PB)实验设计的原理是基于不完全平衡模块原理，是一种近饱和的两水平优化的试验方法，可以通过较少的试验次数使众多因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出最为重要的几个因素，以供进一步研究[8-9]。

本研究采用N=12的PB设计，对初始发酵培养基中豆粕水解液X2、玉米浆X3、酵母浸粉X4、谷氨酸钠X5、尿素X6、MgSO4·7H2OX7、(NH4)2SO4X8、KH2PO4X9和KH2PO4X10进行考察，X1为无添加情况。每个因素取两个水平，即高水平(+)和低水平(-)，其中高水平为低水平的1.5倍，响应值Y为尿苷产量(g/L)。实验设计及发酵尿苷产量见表1。

表1 N=12 的Plackett-Burman实验设计及响应值

利用Minitab 16软件对结果进行分析，各因素的编码水平和主效应分析见表2。其中P值大小代表了该因素的显著性水平，P<0.05说明该因素效应显著，P<0.01则效应极显著。由表2可知：酵母浸粉、谷氨酸钠和豆粕水解液对尿苷产量有显著影响的因素，且酵母浸粉对尿苷产量的影响最为显著。

表2 各因子实验水平及主效应分析Table 2 Levels of variables and analysis of the main effect

2.2 不同型号的酵母浸粉对尿苷发酵过程的影响

酵母浸粉即粉状酵母浸出物，是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩和干燥等工艺制成的一种富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分的生物培养基产品，广泛应用于发酵工业[10]。因受原料来源、生产工艺以及酵母浸粉本身组分的复杂性的影响，不同厂家、型号和批次的酵母浸粉质量存在差异，从而影响其使用效果[11]。本研究通过单因素实验的方法考察了7种不同来源、不同型号的酵母浸粉对尿苷发酵的影响，分别是OXOID LP0021(LP)、Springer 2506(S2506)、Springer 800(S5041)、Springer 5041(S5043)、安琪FM802(FM803)、安琪FM888(FM888)和安琪FM902(FM902)。用上述7种酵母浸粉进行尿苷发酵所得结果见图1。

图1 使用不同型号酵母浸粉时的尿苷发酵结果 Fig.1 Results of uridine fermentation with different types of yeast extract

从结果可以看出：来源于不同厂家不同型号的酵母浸粉对发酵过程中菌体的生长和尿苷的产量会产生不同的影响。七种酵母浸粉中，Springer公司5041型的酵母浸粉对菌体生长最为有利，而2506型号的酵母浸粉则更有利于尿苷的积累。酵母原料及生产工艺的不同会导致不同厂家、不同型号的酵母浸粉中各种组分含量具有差异，从而对尿苷发酵产生不同的影响[12]。

2.3 不同的酵母浸粉用量对尿苷发酵过程的影响

在确定了最佳的酵母浸粉型号以后，本研究采用单因素实验的方法[13]考察了不同酵母粉的使用量对尿苷发酵的影响，结果见图2。在一定范围内，随着酵母浸粉用量的增加，菌体的生长变佳，尿苷产量也逐步提升，但是使用过量的酵母浸粉后，无论是菌体的生长还是尿苷的产量都开始呈现下降趋势。镜检发现：使用过量的酵母浸粉后，发酵后期会有大量芽孢生成，可能是因为前期营养太丰富，导致菌体增殖太快，营养急剧消耗；后期营养缺乏，导致芽孢生成。较为适宜的酵母浸粉用量为20 g/L。

图2 不同酵母浸粉使用量的尿苷发酵结果 Fig.2 Results of uridine fermentation with different dosage of yeast extract

2.4 酵母浸粉添加方式对尿苷发酵过程的影响

本研究通过发酵罐发酵的方法对比了酵母浸粉的3种不同添加方式对尿苷发酵的影响。第一种方式是将所有的酵母浸粉全部通过底料添加(20 g/L)；第二种方式是通过底料添加一部分酵母浸粉(10 g/L)，然后在发酵过程中再添加一部分(10 g/L)；第三种方式是通过底料添加一部分酵母浸粉(5 g/L)，其余的随着葡萄糖一起流加(15 g/L)。发酵结果如图3，4所示。从发酵结果看：按第一种方式使用酵母浸粉，菌体前期生长迅猛，生物量很快达到峰值，但是菌体会提前衰亡，导致发酵周期过短；而第三种方式，可以很好地控制菌体的生长，菌体活力维持时间更久，更有利于尿苷的发酵[14]。在酵母浸粉随糖流加的条件下发酵40 h，发酵液中尿苷质量浓度可达26.2 g/L，相比酵母浸粉底料添加的方式，尿苷产量提高了101.5%。

图3 酵母浸粉不同添加方式下的菌体生长曲线 Fig.3 Growth curve of strain under different usages of yeast extract

图4 酵母浸粉不同添加方式下的尿苷产量 Fig.4 Titer of uridine in fermentation under different usages of yeast extract

3 结 论

研究结果表明：酵母浸粉是培养基中影响尿苷产量的最显著因素。酵母粉的种类、使用量和使用方式皆会影响尿苷发酵生产。通过对比不同厂家、不同型号的酵母浸粉对尿苷发酵的影响，发现Springer公司所产的2506型号的酵母浸粉最有利于尿苷发酵，并摸索出其最佳的使用量为20 g/L。在尿苷分批补料发酵的过程中，5 g/L的酵母浸粉在底料中添加，其余的15 g/L随糖流加更有利于发酵过程中尿苷

的积累，在最优条件下，枯草芽孢杆菌F126在5 L发酵罐上发酵40 h后可积累尿苷26.2 g/L。