辅助生殖技术中嵌合胚胎的发生机制及结局

杨小璇，吴畏

存在两种或两种以上不同核型细胞系的胚胎被称为嵌合胚胎。根据其起源，嵌合体有由单个受精卵发育而来（mosaicism）与非单个受精卵发育而来（chimerism）之分。人类辅助生殖技术中，对于有必要行遗传学诊断的患者，一般选择胞浆内单精子注射（ICSI）的体外受精方式，以最大限度减少母源颗粒细胞和父源精子对下游遗传学检测准确性的干扰。因此，这里只讨论由单个受精卵发育而来的嵌合胚胎。非整倍体胚胎的形成，是由于减数分裂形成配子的过程发生错误；嵌合是有丝分裂过程中，部分细胞染色体分离异常，导致染色体增加或丢失，成为非二倍体细胞，其发生机制本质上都是有丝分裂错误的发生机制，并非嵌合型所独有。这些有丝分裂错误发生的原因尚不清楚。随着新的遗传技术平台的发展，对移植前胚胎倍性状态的诊断不再局限于整倍体或非整倍体，而是通过量化异常细胞比例进行分类[1]。国际植入前遗传学诊断协会（the Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS）将嵌合比例＜20%的胚胎视为整倍体，＞80%视为非整倍体，20%～80%视为嵌合体，以此指导胚胎检测结果的判定。

1 嵌合胚胎的分类

按嵌合的分布，嵌合胚胎可分为两种：第一种为广泛嵌合，指胚胎的胎盘和胎体均出现嵌合，分裂错误发生较早，导致嵌合细胞系存在于整个胚胎；第二种为局限性嵌合，指染色体嵌合局限在内细胞团的部分或全部细胞，或者滋养外胚层的部分或全部细胞[2]。此种类型发生率更高，有出现在脑部、性腺、胎盘等部位的报道[3]。当有丝分裂错误发生在胚胎细胞已分化的阶段，如出现在滋养层，分化后就只有胎盘嵌合，胎儿可为整倍体，从而形成局限性胎盘嵌合（confined placental mosaicism，CPM）。CPM与胎儿生长受限、自发性流产、死胎及胎盘功能异常等有关。

按染色体组成，嵌合胚胎可分成3种：第1种为非整倍体嵌合，是不同非整倍体细胞的混合（即胚胎中没有二倍体细胞），在卵裂期胚中约占15%[4]。有丝分裂错误发生在已经出现减数分裂错误的胚胎，或有丝分裂错误发生在第一次卵裂，从而产生了两种不同类型的非整倍体子细胞而形成。第2种为二倍体-非整倍体嵌合，指胚胎中既有非整倍体细胞，又有二倍体细胞，在卵裂期胚胎中约占50%[4]。通常由于二倍体受精卵的子代细胞发生有丝分裂错误而产生。罕见情况中，非整倍体细胞自我补救产生的二倍体子代也可导致该种嵌合类型[5]。倍性嵌合也称为混倍体胚胎，是不同倍数细胞的混合。早期植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）研究使用荧光原位杂交（FISH）技术发现了卵裂期二倍体-四倍体嵌合的高发生率（15%）[6]。第3种为杂乱嵌合，表现为多条染色体异常的无规律形式，每个细胞具有看似随机的染色体数目。不同研究的标准和估计不同，其发生率约为25%[6]。

2 嵌合胚胎的发生机制

2.1 分裂后期延迟 即细胞分裂发生在染色体正确排列并附着于有丝分裂纺锤体之前，使某一条染色单体未能进入子代细胞核[3]，形成一个单体和一个二倍体细胞。在移植前胚胎中，染色体丢失导致的有丝分裂错误比染色体增加更常见，出现在超过50%的病例中[7]。Ioannou等[8]在对丢弃的第5天胚胎的研究中，证明单体嵌合比三体发生率高7倍，提示细胞分裂后期延迟可能是嵌合的主要原因。

胚胎基因组在四至八个细胞阶段前基本处于非激活状态，来自母亲的蛋白质和mRNA储备调控前几次有丝分裂[9]。最近有研究使用单细胞表达谱来鉴定非整倍体/整倍体和发育阻滞/正常的胚胎中差异表达的母体效应基因，发现发育阻滞的受精卵中，有丝分裂检查调控位点的相关基因下调，包括CDK1、CDK2、CHEK2、BUB1、BUB3、乳腺癌易感基因1（BRCA1）和ATR[10]。随着母亲年龄增加，辐射、毒性物质、氧自由基累积，卵子质量下降，线粒体受损或端粒缩短都可致有丝分裂错误。高龄导致非整倍体发生率升高，但目前的数据和观念认为嵌合发生率与年龄无关。

卵裂期的胚胎有丝分裂检查位点的作用薄弱，可能导致细胞周期在染色体完全复制并正确排列于有丝分裂纺锤体之前或清除损伤DNA之前就进入M期[11]。延时成像研究表明，在没有严格检查调控的细胞周期中，有丝分裂保真度由于关键细胞周期节点的轻微偏差而下降，出现频繁的后期延迟[12]。监控M期染色体的分离依靠纺锤体装配检查位点（spindle assembly checkpoint，SAC），SAC降调可导致一条姐妹染色单体与纺锤体连接失败，或者两条姐妹染色单体连接到同极纺锤体上，以及一个着丝粒与两极纺锤体同时连接。错误的连接使染色体向两极的移动延迟，增加后期延迟的发生率[13]。宽松的细胞周期检查位点也可导致细胞分裂跳过M期，DNA复制而细胞不分裂，形成四倍体嵌合。

2.2 有丝分裂不分离 即姐妹染色单体在有丝分裂过程中未分离，使两条染色单体进入同一个子代，形成一个三体和一个单体细胞的相互获得/丢失的模式。其发生率与胚胎发育阶段和所涉及的染色体有关，是卵裂期性染色体不分离的主要机制，而与减数分裂Ⅰ期和Ⅱ期常染色体非整倍体的形成关系甚微[3]。姐妹染色单体不分离或过早分离都与聚合蛋白的功能障碍有关。在小鼠模型中，敲除聚合蛋白基因会导致早期胚胎发育阻滞[14]。而预期会出现发育阻滞的受精卵表现出一些聚合蛋白基因包括SMC3和分离酶抑制蛋白的表达差异[10]，因此聚合蛋白对有丝分裂保真度的重要性值得进一步研究。

2.3 内复制 是指染色体复制而没有随后的胞质分裂，或者有丝分裂开始不久后随即关闭，形成一个三体和一个二倍体细胞[3]。

2.4 染色体丢失 在细胞周期的任何时期发生的染色体丢失都可导致嵌合。

2.5 提前分离 指细胞间期DNA复制完成前即启动细胞分裂过程。

2.6 断裂-融合-桥循环 即染色体片段融合形成双着丝粒染色体。细胞分裂时，每个着丝粒被拉向相反方向，染色体在新的位置断裂，断裂染色体片段复制后再融合，开始新的循环。这种错误会导致复杂的染色体重排而出现嵌合[15]。其发生是由于后期延迟的染色体并不直接退化，而是从主细胞核中分离出来，被包裹进类似细胞核的微核中，易发生严重的DNA损伤[16]，形成双着丝粒染色体，也易发生染色体碎裂，以随机顺序和方向重新组合，导致大量的染色体片段缺失和重排。当多个染色体被分割进入一个微核时，还可能导致易位[17]。微核可在随后的有丝分裂中被重新吸收入细胞主核或与邻近卵裂球融合，导致复杂的嵌合模式[12]。

另外，来自精子的中心体若出现异常会导致卵裂期胚胎的有丝分裂错误，产生严重的杂乱嵌合。调控中心体复制的有丝分裂激酶Polo-蛋白激酶4（Polo-like kinase4，PLK4）即使是轻微的过表达，也会导致中心粒过多，形成多余的中心体[18]，使细胞出现多极，产生多个子细胞，染色体随机分配到子细胞中，导致杂乱嵌合。双精受精也是造成中心体过多的一个路径[19]。也有正常二倍体卵裂球出现多极有丝分裂的报道[20]。在受精过程中，精子的中心粒促使微管聚合形成精子星状体，其引导精卵原核相融，并从卵子提供的细胞质中募集中心体的成分。不育男性星状体的形成比正常男性延迟。

3 嵌合胚胎的检出率及影响因素

胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic test，PGT）是对有遗传缺陷高风险的夫妇，通过体外受精，应用分子、细胞遗传学技术，在体外选择正常胚胎植入，亦称孕前诊断。最初的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术能检测的染色体数目有限。近年来发展迅速的全染色体筛查技术（comprehensive chromosome screening，CCS），包括定量聚合酶链反应（qPCR）、单核苷酸多态性分析微阵列（single nucleotide polymorphismarray，SNP arrays）、微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCHG）及最新的新型高通量测序技术（next generation sequencing，NGS），已经可以准确检测23对染色体的拷贝数。

各种检测方法估计卵裂期胚胎的嵌合率在15%～75%[21]。第5天/第6天囊胚期的滋养外胚层（trophectoderm，TE）活检可以获得更多细胞，检测结果更加稳定可信。囊胚嵌合率在3%～24%[22]，但是嵌合的类型、程度，活检的位置、细胞数目都应当纳入对TE活检准确性的评估中。全基因组检测技术不能发现互补的染色体异常；不同的嵌合形式使单次TE活检在理论上很容易出现误诊[2]，其能否代表整个胚胎的倍性状态，仍存在争议。Johnson等[23]和Capalbo等[24]的研究提示TE和ICM的一致性高达95%～100%。Maxwell等[25]对TE+NGS检测为嵌合体的胚胎进行2～5次重复的TE检测，再次TE检测认为48.2%仍为嵌合体，51.7%为整倍体。可见TE活检对ICM的代表性存在一定的误差。PGDIS推荐活检5个细胞。Gleicher等[26]经过数学模型计算，认为每次活检至少27个细胞，才能代表约含300个细胞的TE。

在嵌合胚胎的检测中，除了生物学因素导致的困难，还有检测方法数据分析带来的挑战[27]。不同的全基因组扩增和检测平台、分析软件及设置、嵌合评估原则和标准都会影响检测结果[21]。所使用的PGT嵌合检测敏感度（即整倍体和非整倍体细胞混合物中可检出嵌合的最小非整倍体细胞比例）也会影响嵌合检出率。2016年PGDIS指南提出，有效的NGS平台现需要能够发现嵌合率为20%左右的胚胎。

此外，一项大样本的回顾性队列研究表明，PGT平均整倍体率约39.5%～82.5%，平均68.4%，各个生殖中心间有差异。不同中心的不同卵巢刺激方案、激素水平及实验室因素是否影响嵌合率，不同的研究结果相反，有待进一步研究。Munne等[28]认为，胚胎培养条件及培养液可导致嵌合现象的差异。与大气氧含量相比，5%的氧气培养环境可以提高胚胎质量，降低性染色体嵌合。

4 临床结局

嵌合胚胎的发育潜力、种植率下降，遗传疾病、不良妊娠结局的风险增加。有严重精神障碍和自身免疫性疾病的个体染色体嵌合发生率较高的报道[2]。在最初胚胎检测结果定性为整倍体和非整倍体时，认为只有整倍体胚胎可以孕育健康后代，但Greco等[29]2015年的研究表明一部分嵌合体胚胎可以发育为健康活产儿，Munné等[30]2017年的研究表明，41%嵌合胚胎移植后可以获得继续妊娠。因此嵌合体胚胎很可能有自我纠错的潜能，应重新考虑嵌合胚胎的选择性移植。正常4～8细胞阶段由于逐渐下降的核质比而触发胚胎基因组激活（embryonic genome activation，EGA），细胞分裂保真度增加。染色体不分离的发生率从第一次有丝分裂时的＞25%降至8细胞阶段后的＜5%。与卵裂期相比，囊胚的嵌合比例下降，染色体异常所致的严重程度下降。有3种假说解释这种现象：第1种，嵌合胚胎在形成囊胚前已凋亡。第2种，非整倍体细胞主动清除，或较整倍体细胞增殖速度更慢。最近一项使用小鼠模型的研究支持这一假说，证明当二倍体细胞的比例足够大（≥50%）时，嵌合胚胎可以完成自我纠正[31]。特定细胞系的克隆消耗可以解释CPM的发生。第3种，单/三倍体补救，即非整倍体细胞再次有丝分裂错误而成为二倍体，这种补救机制相对少见，且可导致与广泛临床疾病相关的UPD，其发生率有待研究。

目前还不能明确胚胎嵌合比例对发育潜力的影响，但是比例较低的胚胎着床机会大。非整倍体细胞占40%～80%的嵌合胚胎，持续妊娠率（ongoing implantation rate，OIR）约为22%，＜40%的嵌合胚胎OIR则高达56%，复杂嵌合类型胚胎的OIR（10%）明显较低，单倍体、三倍体及节段性嵌合体OIR的差别没有统计学意义[30]。采用分级系统预测嵌合胚胎插入类型，可能改善PGS后IVF结局[21]。

任何情况下都优先移植整倍体胚胎，对于IVF的患者尤其是高龄妇女，若所获胚胎只有嵌合体，且患者不能或不愿经历再次取卵，可根据胚胎嵌合程度、染色体异常类型，结合患者的既往史和自我期望，选择移植遗传风险较低的胚胎。由于常染色体单体通常不能存活，而特定的三体可致活产儿身体或认知缺陷[32]，PGDIS2016年指南建议优先移植单体嵌合而非三体嵌合，若移植三体嵌合，1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、17、19、20、22 、X和Y染色体三体嵌合胚胎优先移植，2、7、13、14、15、16、18和21染色体三体嵌合胚胎不优先移植。希望所选择的胚胎有“全或无”效应，即胚胎种植、妊娠后可以活产完全健康的孩子，或种植失败、早期流产，从而避免不良妊娠结局。然而PGDIS指南也指出，由于缺乏足够的临床证据，嵌合胚胎仍有待各方面的进一步研究。但目前对于移植前与患者充分的遗传咨询已达成共识，需告知嵌合胚胎结局的不确定性和流产、胎儿异常、妊娠终止等各种可能的风险，并建议其进行早期的产前筛查和后期的羊水穿刺检查。

5 结语

由于嵌合胚胎形成机制的复杂性及发育过程的未知性，目前还不能建立基因型和表型的联系，在胚胎发育过程中，为何部分细胞发生有丝分裂错误，尚不清楚。每个嵌合个体的异常细胞比例、染色体异常的类型和组织部位均不同，个体差异大，因此发育结局极不确定[33]。目前关于移植嵌合胚胎后临床结局的数据还非常缺乏。NGS应用的增加、数据的搜集及妊娠随访有望提供关于嵌合胚胎发育结局更为详细的观点。