谷氨酰胺代谢对卵巢肿瘤细胞生物学行为的影响

李文静，孙斯曼，李默

卵巢肿瘤是妇女恶性肿瘤死亡率最高的肿瘤，据估计全世界每年因卵巢肿瘤死亡者达150 000人。2018年美国癌症统计数据显示，卵巢癌新发病例达22 240例，死亡数达14 070例[1]。由于早期缺乏确切症状，大部分卵巢癌患者当疾病进展至晚期阶段才被发现，这是不良预后的重要原因。若卵巢癌早期被发现，5年生存率可达92.4%[2]。因此，临床医生们迫切寻求疾病的早期诊断方法来降低卵巢癌死亡率。卵巢上皮肿瘤是最常见的卵巢恶性肿瘤，起源于卵巢表面的上皮细胞，占卵巢恶性肿瘤的80%～90%[3]。研究发现糖和谷氨酰胺（glutamine，Gln）是卵巢癌细胞快速增殖时所需能量的主要来源，尤其是Gln，癌症患者谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）活性显著升高，该酶是Gln分解代谢的限速酶，与肿瘤生长、肿瘤血管生成及肿瘤免疫都有重要的关系。据报道Gln对卵巢癌细胞的生长、侵袭、化疗药物抵抗等具有重要影响。因此有必要综合现有文献对Gln代谢和卵巢癌相关研究做一综述，进一步明确Gln在卵巢癌中的研究意义。

1 Gln概述

1.1 Gln代谢网络 Gln是谷氨酸衍生物，参与嘌呤和嘧啶的合成，是体内最丰富的氨基酸，线粒体是其代谢场所。Gln的合成和分解代谢是由不同的酶催化的不可逆反应。氨和谷氨酸在谷氨酰胺合成酶催化下生成Gln，同时GLS分解Gln产生谷氨酸和氨。谷氨酸参与丝氨酸的合成，丝氨酸在丝氨酸羟甲基转移酶作用下生成甘氨酸，甘氨酸进一步参与谷胱甘肽和嘌呤合成[4]。Gln通过增加谷胱甘肽形成参与抗氧化防御功能。另外，Gln分解代谢产生的α-酮戊二酸可以回补进入三羧酸循环。研究发现Gln剥夺或抑制其分解代谢会阻碍急性髓系白血病细胞系HL-60生长[5]。在低氧条件下或线粒体功能受损时，Gln是脂肪酸合成碳的主要来源[6]。

1.2 GLS GLS是Gln分解代谢产生谷氨酸和氨的关键酶。GLS有2个不同的磷酸活化类型，GLS1和GLS2，在哺乳动物中由不同染色体上单独的基因编码。先前研究认为GLS1上调与细胞增殖速率增加有关，而GLS2似乎更偏向与静息或休眠状态细胞有关[7]。Suzuki等[8]发现GLS2是P53靶基因，DNA损伤或氧化应激时以P53依赖的方式诱导GLS2的表达。卵巢癌患者中，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2（PI3K/AKT/mTORC2）通路时常被激活，mTORC又参与细胞增殖与存活、细胞迁移、血管生成和新陈代谢等重要生理活动。研究显示阻断GLS1会显著促进PP242诱导的细胞死亡（PP242是mTORC1和mTORC2双重抑制剂），特异性靶向该途径可能是治疗卵巢癌非常有前途的方法。此外，抑制GLS1可降低卵巢癌细胞磷酸化的信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表达[9]。近年多数研究认为，Gln代谢途径在卵巢癌进展中有重要作用，GLS高表达与卵巢癌的转移和5年生存率降低有关[10]。

2 Gln在肿瘤发生过程中的作用

癌症会经历一系列代谢重编程过程，以满足肿瘤细胞生长、侵袭的能量需求[11]。Pavlova等[12]总结了六大肿瘤代谢标志：①糖和氨基酸摄取失控；②利用获取营养的机会主义模式；③利用糖酵解或三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TAC）中间代谢物进行生物合成以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）；④氮需求增加；⑤代谢驱动基因改变；⑥新陈代谢和微环境交互作用。葡萄糖和Gln是肿瘤细胞能量供应的两大主要物质[13]。其中，瓦氏效应（Warburgeffect，癌细胞在有氧条件下通过糖酵解途径消耗大量的糖类产生ATP和乳酸）是癌症细胞最广为人知的代谢特点[14]。尽管癌细胞糖酵解率高，但是线粒体氧化磷酸化可以保持完整并使肿瘤细胞逐步对Gln代谢产生依赖。1955年Eagle[15]首次提出增殖的肿瘤细胞需要高水平的Gln。培养基中Gln水平与肿瘤细胞增殖相关，血清Gln水平与肿瘤侵袭有关[16]。Gln通过增加谷胱甘肽（GSH）水平，降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平和提供NADPH参与抗氧化防御[17]。近年来有证据表明部分恶性肿瘤依赖Gln维持能量需求[18]，Gln利用最关键的一步是在线粒体酶GLS分解下转换成谷氨酸，谷氨酸和谷氨酸衍生代谢物可以为三羧酸循环提供中间代谢物，生成谷胱甘肽，促进脂肪酸合成。

3 Gln与卵巢癌

3.1 Gln促进卵巢癌细胞生长 Gln是肿瘤细胞生物合成的最主要的营养物质之一。通过分析细胞毒性、细胞周期进展、凋亡、细胞应激和葡萄糖/Gln代谢评估卵巢癌细胞系（HEY，SKOV3和IGROV-1）对Gln的依赖，结果显示3种细胞系增殖对Gln呈剂量依赖特征[19]。Gln可以促进细胞从G1期进入S期，膜联蛋白V（Annexin-V）实验分析Gln对细胞凋亡的影响发现，卵巢癌细胞在Gln缺乏的培养基中凋亡率显著增加，同时诱导ROS产生和细胞应激相关蛋白表达上调。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPKs/ERK）和PI3K/AKT/mTOR途径对控制卵巢癌细胞生长和存活具有非常关键的作用，Gln可以增加S6（Ser235/236，S6是mTOR的底物）和p42/44（ERK）磷酸化，表明MAPK/ERK和mTOR/S6参与了Gln代谢。mTOR抑制剂雷帕霉素可以强烈抑制S6的磷酸化以及GLS的表达，Gln通过mTOR/S6途径促进卵巢癌细胞增殖。另外，Gln通过调节mTOR/S6和MAPK途径增加GLS和谷氨酸脱氢酶（GDH）活性[20-21]。以上研究提示，Gln代谢对卵巢肿瘤的生长具有非常重要的促进作用，因此是否能从Gln代谢通路中，靶向关键的合成酶，寻求卵巢癌新的治疗方案值得深入探讨。

3.2 Gln与卵巢癌细胞侵袭相关 多种不同的肿瘤微环境说明细胞需要合适的营养物质维持生长、侵袭和能量代谢。越来越多的研究表明，肿瘤细胞代谢依赖主要由癌基因改变和重新设置细胞代谢过程促进肿瘤发生。然而近来关于癌症侵袭和恶性肿瘤研究显示，肿瘤代谢依赖更加明显。葡萄糖（Glc）和Gln促进肿瘤细胞生长，而肿瘤细胞侵袭和迁移能力与肿瘤细胞特有的代谢物质依赖尚不清楚。糖代谢与肿瘤细胞存活途径的交互作用影响侵袭、迁移和能量平衡。许多针对糖酵解的靶向药物通过活化表皮生长因子受体（EGFR）、癌基因Src、詹纳斯激酶（Janus-activated kinase，JAK）和ERK途径调节细胞分化、抗凋亡反应和转移，但是Gln代谢与控制肿瘤细胞表型的网络尚不清楚[22-23]。卵巢癌患者代谢网络显示，预后不良的患者Gln分解代谢相关基因呈高表达，包括GLS1、谷氨酸脱氢酶（GLUD1）、谷草转氨酶1（GOT1）和GOT2以及三羧酸循环相关基因[如丙

酮酸脱氢酶（PDH），柠檬酸合成酶（CS），顺乌头酸酶（ACO2）和琥珀酸脱氢酶（SDHB）]，这与葡萄糖进入三羧酸循环涉及的基因表达情况相反。采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术通过靶向代谢组学分析OVCAR3和SKOV3卵巢癌细胞系相关代谢产物丰度发现，低侵袭性卵巢癌细胞（low invasive ovary cancer，LI-OVCA）糖酵解途径（丙酮酸，乳酸）和三羧酸循环（柠檬酸，苹果酸，延胡索酸）代谢产物高于高侵袭性卵巢癌细胞（high invasive ovary cancer，HI-OVCA）。利用同位素示踪技术和生物能学分析发现，LI-OVCA是Gln非依赖的，而HI-OVCA是Gln显著依赖的，说明在高侵袭性的卵巢癌中，Gln代谢支撑了线粒体三羧酸循环活性。因此是Gln代谢与卵巢癌不良预后有关，而不是糖酵解[19]。

3.3 Gln与卵巢癌化疗药物抵抗 铂类和紫杉醇是卵巢癌一线化疗药物，虽然80%卵巢癌患者对以铂类为基础的一线化疗方案敏感，但复发率却高达60%以上，其中大部分患者在一线化疗后出现继发性铂类耐药，导致复发性卵巢癌患者预后极差[24-25]。研究证实c-myc通过三羧酸循环和氧化磷酸化调节铂类抵抗的卵巢癌细胞系对Gln代谢的依赖。目前，将代谢途径作为研究目标来增强卵巢癌治疗疗效及克服药物抵抗是较为引人注目的研究方向。在铂类敏感的卵巢癌细胞系A2780中，铂类药物治疗最初糖和Gln的代谢是上调的；相反，铂类抵抗的细胞系CP70中对Gln的存在显著依赖，并伴随着Gln转运蛋白ASCT2和GLS表达上调。通过GLS稳定过表达证实了因为Gln代谢的重要作用才引起了铂类抵抗，如果在铂类抵抗的卵巢癌细胞中采用小发夹RNA（shRNA）降调GLS的表达可以使细胞重新对铂类治疗敏感。重要的是在体外，GLS抑制剂（BPTES）和铂类联用可以协同抑制铂类敏感和抵抗的卵巢癌。铂类联合BPTES与单一铂类治疗相比，肿瘤细胞凋亡诱导显著增加。因此，Gln代谢通路和以铂类为基础的化学疗法联合使用是卵巢癌潜在的治疗策略，特别是耐药性卵巢癌[26]。

4 结语

卵巢癌常发生在围绝经期女性，由于早期缺乏明显的症状和有效的诊断方法，其死亡率一直处于妇科肿瘤第一位。近十年来肿瘤代谢组学研究重新引起研究者们的注意，肿瘤代谢改变特点首次发现至今已近一个世纪前[27]，采用新的生化和分子生物学手段研究肿瘤代谢有助于增加对不同时期肿瘤相关代谢改变机制和功能的理解[12]。其中Gln作为第二大肿瘤营养物质来源成为卵巢癌代谢研究的新方向。上述研究表明Gln分解代谢有助于卵巢癌细胞的生长和侵袭，通过抑制Gln分解代谢酶类如GLS，能有效阻滞癌症侵袭并增加铂类抵抗的卵巢癌细胞重新对铂类化疗药物敏感。因此，靶向Gln分解代谢途径，对寻求卵巢癌诊断和预后标记物以及新的治疗靶点意义重大。