射频消融技术联合TACE诱导肝癌细胞凋亡的机制

邢燕来 王晓磊

目前对原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)的治疗仍以外科治疗为主，但是其术后并发症较多，患者预后状况较差[1-2]。射频消融技术(radiofrequency ablation，RFA)将射频电极插入肿瘤中并输出能量，提高细胞内的温度至90℃，从而毁损肿瘤细胞[3-4]。TACE术(transcatheter arterial chemoembolization)多用于治疗肝癌[5-6]。新型长链非编码 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度超过200 核苷酸(nucleotide，nt)的调节性非编码 RNA，其在肝癌、喉癌和直肠癌中起关键作用[7-8]。本研究即探讨新型长链非编码RNA在肝癌中潜在的生物学功能和机制。

资料与方法

一、研究对象

选取2014年1月至2015年12月期间来我院就诊的185例肝癌患者作为研究对象。所选185例肝癌患者中男性患者105例，女性患者80例，年龄48～78岁，平均年龄(64.30±5.17)岁。所有参试者均自愿签订同意书，配合参加本次研究。受试者分为试验组和对照组，试验组(n=95)实施冷循环射频术联合TACE术，对照组(n=90)实施传统手术切除。入选标准：临床诊断肝癌患者；无其他肿瘤疾病及免疫系统疾病病史；其他身体指标符合正常标准。剔除标准：近期做过大型手术；接受过放疗或者化疗等治疗方法；不能配合完成试验者。本研究已经获得医院医学伦理委员会批准，且受试者均已签署书面知情同意书。

二、治疗方法

(一)受试者实施冷循环射频术联合TACE术。即先给予患者TACE治疗，使用Seldinger 行股动脉穿刺插管，于DSA下实施肿瘤供养动脉造影，选取吡喃阿霉素60 mg、碘化油30 mL混合乳化物行栓塞治疗，然后导管灌注卡铂300 mg。TACE治疗1周后，再进行RFA 减瘤治疗(LDRF-120S射频消融治疗仪)。RFA针刺入肿瘤中心，消融针展适合直径，行重叠消融减瘤治疗，消融范围延伸周边正常组织1 cm位置。收集患者的肝癌组织标本，采用荧光定量检测的方法得到患者癌组织标本的RNA表达量[7-8]。对照组实施传统手术切除肿瘤组织。

(二)采用应用q-PCR检测(美国 Primerdesign公司Q-PCR试剂盒；用GAPDH基因作为内参)方法检测患者癌组织标本的长链非编码RNA- AK054978及长链非编码RNA- FER1L4在肝癌患者肝癌组织及癌旁组织中的表达水平。热循环采用Tach-down程序：94℃ 5 min -(94 ℃ 20 s ～ 65 ℃ 1 min ～ 72 ℃ 2 min)1个循环,然后退火温度每循环降低1℃ ,降至61℃时进行36个循环。设定在每个循环72℃延伸后期收集荧光数据。热循环完成后进行60℃～95℃的融解曲线测定。

(三)构建长链非编码RNA- AK054978及长链非编码RNA- FER1L4的质粒，分别电转染SMMC-7721人体肝癌细胞株(美国ATCC公司)。运用Transwell 小室(德国 默克密理博公司)实验检测肝癌细胞的组织生物学特性，对比分析癌细胞转染后组织细胞迁移和细胞侵袭能力。Transwell 小室上室面用 Matrigel(50 mg/L)按 1∶8 稀释液包被后以 FN 涂抹在小室下面并干燥，紫外线消毒 30 min。各孔加入 1% BSA 无血清培养基 0.1 mL，Matrigel充分浸润后吸掉残余培养基。制备细胞悬液，将细胞浓度调整为 1×106个/mL，细胞悬液 0.2 mL(1×105)加于预包被培养板各孔，于下室缓慢加入 10 % FBS 培养基 0.5 mL，温箱培养 16 h。用棉签将 Transwell 小室上室面未穿过基底层膜的细胞擦去，注意不要破坏基底层膜，显微镜下进行计数细胞并比较。通过流式细胞仪(北京博奥CytoNova系列流式细胞仪)检测各组肝癌细胞凋亡变化[7-8]。将待测细胞制成单细胞悬液，离心弃上清，沿管壁缓慢加入700 mL/L预冷 (-20 ℃)乙醇固定，上机检测前RNA酶消化，再加入PI染色液，4 ℃避光30 min，使用FCM检测凋亡率及细胞周期。

三、统计学处理

结 果

一、试验前，对所有肝癌患者的基本临床资料进行调查统计，试验组(n=95)，性别(男/女)为50/45，平均年龄为(50.32±8.96)岁；分化程度低者18例、分化程度中者32例、分化程度高者45例，淋巴转移阳性者60例、淋巴转移阴性者35例，远处转移阳性者51例、远处转移阴性者44例；对照组(n=90)，性别(男/女)为47/43，，平均年龄为(48.85±9.62)岁，分化程度低者16例、分化程度中者28例、分化程度高者46例，淋巴转移阳性者57例、淋巴转移阴性者33例，远处转移阳性者47例、远处转移阴性者43例。各组受试者的一般情况进行比较，结果显示无统计学差异(P>0.05)。此外，研究过程中所有受试者均完成了全部试验，无中途退出者，亦无改用其他疗法者。

二、TACE联合射频消融治疗后CT显示：射频消融后复查，见病灶大范围坏死，但是肿瘤内侧及外侧均见结节状强化，提示肿瘤有残余。新型长链非编码RNA(lncRNA)在肝癌患者癌组织中的表达量高于与其对应的癌旁组织。经过β-actin均一化后，得到两种lncRNA在不同组织中的相对定量(ΔCt= Ct lncRNA-Ct β-actin)。试验组(n=95)：AK054978(Ct)为35.35，FER1L4(Ct)为25.15，β-actin 为18.32，AK054978(ΔCt)为17.03±5.21，FER1L4(ΔCt)为6.83±4.23；对照组(n=90)：AK054978(Ct)为32.26，FER1L4(Ct)为30.36，β-actin 为19.01，AK054978(ΔCt)为13.25±4.87，FER1L4(ΔCt)为为11.35±4.22。对比AK054978、FER1L4在两种组织中的表达差异，肝癌组织中AK054978的表达明显提高，属于上调型(P<0.01)，相反，FER1L4的表达显著下降，属于下调型(P<0.01)。

三、对肝癌患者癌组织的生物学功能进行检测，发现AK054978 转染组：细胞增殖(OD)为6.92，细胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)为1.68，发生细胞迁移者为50例，发生细胞侵袭者为38例；FER1L4转染组：细胞增殖(OD)为3.89，细胞凋亡(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)为1.04，发生细胞迁移者为0例，发生细胞侵袭者为0例，即长链非编码RNA- AK054978可以加速肝癌中细胞的繁殖，增强细胞迁移、侵袭能力；通过流式细胞仪观察发现AK054978 转染组凋亡率低、FER1L4转染组凋亡率高，即上调长链非编码RNA- AK054978的表达可以减少肝癌细胞凋亡。

讨 论

RFA具有创伤很小，疗效比较确切，并发症少，住院时间短[9-10]。TACE可阻断肿瘤的绝大多数血供，致使肿瘤缺氧，抑制肿瘤生长、促使肿瘤坏死[11]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，lncRNA被转录在肿瘤的发生发展中起关键作用。lncRNA多具有内在的RNA介导的功能转化[12]。

ACE联合经皮肝穿射频消融术(RFA)可明显提高患者的1年和2年生存率；经TACE联合经皮肝穿射频消融术治疗后患者的中位生存期明显长于单独TACE治疗的患者，说明TACE联合经皮肝穿射频消融术可在一定程度上延长患者的生命。

新型长链非编码RNA在肝癌患者癌组织中的表达量高于与其对应的癌旁组织，与TNM分期、细胞分化、淋巴结的转移有密切的关联。为了研究新型长链非编码RNA在肝癌中的潜在生物学功能特性及其分子机制，研究者建立两种RNA表达量不同的肝癌稳定转染细胞，其中AK054978的表达明显提高，属于上调型；FER1L4的表达显著下降，属于下调型。将两种RNA细胞分别导入癌细胞组织中，运用流式细胞技术、细胞划痕实验检测肝癌细胞的组织生物学特性，发现上调lncRNA可以加速肝癌中细胞的繁殖，增强细胞迁移、侵袭能力。利用自噬抑制剂3-MA，通过流式细胞仪观察两种细胞的凋亡情况，发现上调RNA的表达可以使肝癌中细胞发生自我吞噬从而减少细胞凋亡；经倒置电子显微镜观察发现：下调RNA表达量的稳转细胞，细胞形态发生了变化，有逆转的趋势。长链非编码RNA不仅只具有基因组转录的功能，还具备重要的细胞和分子生物学功能。其可通过影响基因组的转录过程和表观遗传信号改变肿瘤的发生发展，潜在的分子生物学功能主要有：调控蛋白活性、改变RNA的模式、调节转录模式等。

综上所述，长链非编码RNA的表达与肝癌的产生和发展有着密不可分的联系；冷循环射频联合TACE通过抑制新型长链非编码RNA表达诱导肝癌细胞凋亡。