胆道微生态与胆总管结石形成关系的研究进展

安爱虎，周文策，张辉

（1.兰州大学 第一临床医学院，甘肃 兰州 730099；2.兰州大学第一医院 普外二科，甘肃 兰州 730099）

胆石症是全世界的主要公共卫生问题之一，是常见病和多发病[1-3]。在西方国家，胆石病患病率男性为7.9%，女性为16.6%，但很少报道有胆总管结石[4]。相比之下，我国胆石病检出率为4.2%～12.1%[5]，其中胆总管结石约占10%～20%[3，5]。胆总管结石属于胆石病范畴，依据结石来源可分为原发性胆总管结石和继发性胆总管结石。原发性胆总管结石初始于胆总管，绝大多数为棕色色素结石；而继发性胆总管结石是指原发于胆囊，经胆囊管迁移至胆总管的结石，多为胆固醇类或黑色素结石[6-7]。值得注意的是，两类胆总管结石的发病机制不同，故本文中若无特殊说明，“胆总管结石”皆指原发性胆总管结石。

胆总管结石在我国是一种常见且危害严重的疾病，由于其残石率、复发率及再手术率高，使其临床疗效尚不令人满意。因此，研究其病因及发病机制对于有效预防和治疗本病具有重要意义。近年来分子生物学技术的发展和应用，为胆道微生物群落与胆总管结石形成关系的研究提供了一个新的契机，使得结石形成机制的研究进入了新阶段。本文将针对胆道微生态与胆总管结石形成关系的研究进展进行综述。

1 胆道微生态与胆总管结石的关系研究

胆总管结石发病机制复杂，目前尚未完全清楚。随着研究的不断深入，许多证据表明胆道微生态与胆总管结石的形成密切相关[8]。

早在20世纪初期就有学者发现胆石病患者的胆汁中有病原菌存在，并鉴定出了大肠埃希菌、链球菌及葡萄球菌等多种细菌，推测胆道细菌感染可能是结石形成的重要原因之一[9]。直到1966年，日本学者Maki[10]提出了经典的胆红素钙结石成因假说：感染胆汁中的细菌，尤其是大肠埃希菌，可产生大量外源性β-葡萄糖醛酸苷酶（β-G），将水溶性的结合胆红素水解为不溶于水的游离胆红素和葡萄糖醛酸，前者再与胆汁中的钙离子结合形成胆红素钙沉淀析出。Higashijima等[11]和Leung等[12]采用体外实验的方法证实了这一结论。我国学者蔡红娇等[13]对胆红素钙结石的形成机制做了进一步的探索，发现胆道细菌感染对肝脏的损害以及细菌酶的作用，改变了胆汁的理化性质，破坏了胆汁胶体的平衡状态，形成成石胆汁，其中去氧胆酸等疏水性物质在酸性促发物的作用下凝集成核，进而促进结石形成。

为了进一步研究细菌在结石形成过程中的作用，Stewart等[14]应用扫描电子显微镜（SEM）对棕色色素结石进行观察，结果发现无论是新鲜结石，还是风干结石，其核心和外周各层均有细菌存在。深入的分析表明不仅细菌的某些代谢产物参与结石的形成，细菌体本身也是结石重要的构成成分[14-15]。Leung等[16]采用同样的方法证实了这一研究成果，此外，还用透射电子显微镜（TEM）观察到细菌被钌红染色的膜状物质所覆盖，推测其可能是细菌生物膜。这种由多糖、蛋白质和脂质等物质组成的生物膜充当了细菌的保护层，允许其在胆道恶劣的环境中生存、繁殖[17]。电镜在胆道微生态研究方面的应用能够敏感地发现培养阴性的细菌，再次证实了细菌参与棕色色素结石的成核及生长，然而却无法明确其作用机制。

随着分子生物学技术的发展和应用，非培养依赖的微生物鉴别方法逐渐应用到胆道微生态研究领域。1995年，Swidsinski等[18]首次运用PCR技术和16S rRNA序列分析法在胆结石中发现了细菌DNA，并得到Kawai等[19]的进一步证实。刘敏等[20]运用PCR-DGGE技术对棕色色素结石患者的胆汁和结石标本进行分析，鉴定出了包括埃希氏菌属在内的9个属的细菌，其中，大肠埃希菌在两种标本中的检出率都是最高的；此外，在胆汁与结石的DGGE指纹图谱相似性分析中，菌落结构的最高相似性系数仅为32.3%，这说明胆汁和结石中的细菌群落并不完全相同。

近年来，基于下一代高通量测序技术的宏基因组学逐渐应用到人类微生物组的研究，使人们对人体微生态有了更加全面、深入的认识[21]。吴韬等[22]首次采用16S rRNA扩增子测序（简称16S测序）技术对胆囊结石患者进行研究，结果显示细菌DNA检出率为100%，并鉴定出胆道核心细菌106种，然而仅有33.96%能匹配到已知的菌种；此外，还发现胆囊结石患者存在明显的肠道菌群失调。Shen等[23]对胆总管结石患者的胆总管胆汁样本进行全宏基因组鸟枪法（whole-metagenome shotgun，简称WMS）测序和16S测序分析，共鉴定出了173种菌种，主要类聚为两大类，其一以来自肠道、口腔和呼吸道的细菌为主，其二以来自口腔和呼吸道的细菌为主。然而，来自口腔和呼吸道的细菌要比肠道细菌更为普遍，因此，除了肠道细菌之外，口腔和呼吸道细菌也可能是胆道细菌的重要来源。同时，基于WMS测序该研究还鉴定出了可能与结石形成和胆汁耐受有关的细菌基因，如uidA基因（编码β-G）和pldA基因（编码磷脂酶A1）。为了进一步探索胆道细菌来源，该研究团队接着对胆总管胆汁、十二指肠液、胃液和唾液标本进行16S测序分析，结果发现胆道菌群与十二指肠菌群更为相似，这在一定程度上说明胆道细菌可能来源于肠道细菌的逆行感染[24]，与梁廷波等[25]的研究结果一致。基于之前的研究成果，Kose等[26]通过WMS测序还发现了与胆汁应激反应和生物膜形成相关的细菌功能基因。

2 胆道细菌的来源

传统观点认为，在正常情况下胆道系统是一个无菌的环境[27]。然而，法医学尸检研究发现，无胆道疾病的病例其胆道中也有细菌存在[28]。这一发现引起了人们探索胆道微环境的兴趣：胆道中是否也像肠道一样存在一个微生态系统？需要注意的是，胆总管胆汁取样困难，且为有创操作，由于伦理问题不能取得无胆道疾病人群的胆汁样本，使得研究进展非常缓慢。为此，Jiménez等[29]对健康猪的胆道系统进行了研究，令人意外的是，其胆道中均发现有细菌存在。这一发现与传统观点相反，使人们对胆道微环境又有了一个新的认识。有研究报道，人体微生物组的某个微生态并不是孤立的，而是相互影响、紧密联系的一个整体[30]。因此，有理由认为人体胆道与肠道微生态之间也有关联。笔者提出这样一个假设：胆道系统中存在一个特殊的微生态系统，这个微生态受到某些因素的干扰而失衡，而这种失衡过程可能与胆道疾病的发生有关。尽管已有很多研究表明细菌可能通过肠胆反流、门静脉系统、胆管周围淋巴系统或多种途径并存而进入胆道[23-25，31]，但至今仍无定论，尚需进一步研究。

3 胆总管结石形成的细菌学机制

3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶

如前文所述，自从经典的Maki假说[10]描述了细菌在胆红素钙结石发生机制中的作用之后的很长一段时间内，细菌源性的β-G一直被认为是棕色色素结石形成的重要原因[12，32]。在以犬为模型的动物实验中，同样证实了这一结论[33]。研究者通过结扎以缩小胆囊管，观察到胆囊中有棕色色素结石形成，进一步分析发现胆囊、胆汁以及肝脏中都有能产生β-G的细菌存在；另外，将大肠埃希菌注入动物模型的脾脏，结果发现脾脏中也有结石形成。

3.2 磷脂酶

有研究报道，棕色色素结石中所含的棕榈酸钙（约占结石干重的15%）与胆道感染细菌所产生的磷脂酶有关[34]。感染胆汁中的磷脂酶水解磷脂生成的棕榈酸与胆汁中的钙离子结合形成不溶于水的棕榈酸钙沉淀，参与棕色色素结石的形成[35]。Stewart等[32]的研究发现感染胆汁中游离脂肪酸浓度和磷脂酶活性均显著增高。Shen等[23]采用WMS测序技术在胆总管结石患者感染的多种细菌中鉴定出了pldA基因，再次从基因水平证明细菌源性磷脂酶参与棕色色素结石的形成。

3.3 黏液和黏蛋白

Maki[10]在研究中发现，向胆红素钙沉淀中加入海藻酸钠可使其凝聚而形成结石。海藻酸钠的化学性质与细菌黏液相似，而黏液的主要成分是黏蛋白，其化学本质是高分子量阴离子糖蛋白，相互凝集构成的网状支架可将胆汁中的胆红素钙、棕榈酸钙沉淀甚至细菌微菌落聚集在一起而形成结石[32，36-37]。Stewart等[36]研究发现，62%的棕色色素结石患者胆道内能检测到细菌源性β-G，但对于细菌黏液而言，这个数字为100%，这表明细菌产生的黏液可能比β-G在结石的形成中具有更重要的作用。

3.4 细菌的自我保护机制

胆道环境中的各种极端因素，如胆汁酸、营养限制、pH及渗透压的变化等构成了细菌生长、繁殖的潜在障碍。然而，有些种类的细菌，例如大肠埃希菌、克雷伯氏菌、肠球菌及产气荚膜梭菌等为了能在胆道系统中存活，在胆汁酸的作下可迅速形成细胞壁缺陷型变体，即L型细菌[38-39]。由于L型细菌致病力不强，抗原性减弱，可逃避机体免疫系统的攻击，同时又因其对细菌细胞壁特异性抗生素的敏感性不同于细菌型[39-40]，故可在胆道系统内长期留存，成为胆道感染的“潜在菌群”，使胆道持续处于慢性炎症状态而有利于结石形成。

除了细菌L型之外，生物膜的形成也是细菌自我保护的一种极其重要的方式，同时在胆道的慢性感染中也有着重要的意义[17]。细菌生物膜的特征在于粘附于介质表面并形成保护性细胞外基质以及包裹于其中的微生物群落，其中，基质约占生物膜干重的90%，通常是由细胞外聚合物，如黏液、蛋白质、脂质、多糖和核酸等组成的复杂的聚集体[41]。与浮游生活方式不同的是，嵌入生物膜内的细菌对宿主的免疫清除、抗生素以及机械应力都具有高度抗性[17，42]。正因为如此，固定于生物膜中的细菌才具有很高的存活率和持久的潜在的感染力，并在小鼠动物实验中得到了证实[43]。

3.5 肠道菌群

人类肠道内生活着数目庞大、结构复杂的微生物群落，因其与人体健康和疾病有着密切的关系，故有学者称其为“被遗忘的器官”[44]。肠道微生态与宿主一同进化，并参与机体代谢、营养及免疫等诸多生理活动[45-46]。正常情况下，肠黏膜屏障可保护机体免遭肠道细菌侵害，然而，当其功能异常或肠道菌群失调时，可引起肠道细菌易位、内毒素血症、炎性介质释放和激活等病理生理过程，从而引起各种疾病的发生[47]。于浩等[48]在以豚鼠为动物模型的研究中发现，破坏其肠黏膜屏障，胆色素结石的发病率明显增高，而与之相比，给予谷氨酰胺改善肠黏膜屏障功能可降低结石形成率。

既往研究发现，肠胆反流是导致胆道感染的主要原因之一[25]。胆总管末端的Oddi括约肌是控制胆汁排放和防止肠内容物反流的唯一门户，其功能状态与胆总管结石的形成密切相关。Oddi括约肌松弛或关闭不全等功能异常时，肠内容物很容易反流进入胆道，致使胆道微环境污染，甚至是胆道感染，进而促使结石形成[49]。

3.6 细菌引起胆总管结石形成的其他机制

胆道慢性炎症是胆总管结石形成的潜在危险因素[43]。如前文3.4所述，细菌的多种自我保护机制使得其能够在胆道系统中长期定植而引起胆道慢性炎症。慢性细菌感染可持续激活胆管上皮细胞的免疫应答反应，分泌大量的炎性细胞因子，如IL-6、IL-10、IL-12（p70）和IL-13等[50]，以及免疫球蛋白，如sIgA、IgM和IgG等[51]，这些物质可以促使细菌聚集而参与结石的形成。此外，持续的局部炎症也会引起胆管上皮损伤，造成胆管壁水肿、增厚，甚至胆管狭窄，而有利于结石形成。

据报道，自由基和内毒素与胆总管结石的形成密切相关，而细菌感染又是人体内自由基和内毒素的重要来源[52-53]。细菌毒素可引起胆管壁炎性反应以及肝细胞损伤，致使肝脏功能异常、代谢紊乱、胆汁成分及理化性质改变而有利于胆总管结石的形成。同时，自由基还是胆红素钙结石形成的触发因子[54]。

4 小结

越来越多的证据表明胆道微生态在胆总管结石的形成过程中发挥着极其重要的作用，但其作用机制至今尚未完全明了。与传统的微生物研究方法相比，基于下一代高通量测序技术的宏基因组学从极大的深度和广度上为人类认识人体微生态和疾病的关系开辟了新的途径。因此，联合运用宏基因组测序技术和传统微生物鉴别方法，对于胆总管结石的发病机制研究、预防和治疗都将具有着重要的意义。