8种水生蔬菜清除水溶性ABTS+自由基活性研究

张海芬，高云涛，*，那吉，马娇，熊华斌

（1.云南民族大学化学与环境学院，云南昆明650500；2.昆明医科大学海源学院，云南昆明650106；3.滇西应用技术大学，云南大理617200）

人类很多疾病以及衰老都与体内自由基氧化损伤有关[1-2]，从天然产物中寻找抗氧化活性物质是目前研究的一个热点[3-5]。水生蔬菜不仅为人类提供所需的糖、维生素、矿物质和纤维素，而且还含有丰富的天然抗氧化剂。因此，水生蔬菜为防治人类一些与自由基损伤有关的疾病提供良好的药物来源，并且在抗衰老过程中起着十分重要的作用[6]。

水生蔬菜（aquatic vegetable）是生长在淡水中，可供食用和药用的维管束草本植物[7]，多具有清火、降燥、清热解毒、降血压和降血脂等作用[8-25]。中医学研究表明，莲藕生食清火[16]；茭瓜利大小便、止热痢；荸荠降火、补肺凉肝；慈姑清热解毒、止咳；水芹菜清热解毒、利水等。随着人们养生意识的增强，药食同源的水生蔬菜逐渐受到人们的重视。现代医学表明，水生蔬菜具有一定的保健和药用功能。如茭瓜可以开胃、预防高血压和动脉硬化等[19]；荸荠有抗肿瘤、抗菌、清肺化痰等作用[24]；水芹菜具有降血压、抗糖尿病、减肥、防止肠癌、防止便秘、抗肝炎、抗疲劳等作用[10-12]。此外，食物的清热解毒作用与其具有的自由清除活性密切相关。迄今有关水生蔬菜的总抗氧化能力研究不够深入，莲藕相关研究较多，其余水生蔬菜并没有受到广泛重视[25]。郝转等[26]研究发现，莲藕多酚提取物能提高机体自由基抗氧化损伤的能力，减轻肝脾细胞DNA损伤程度，从而达到延缓衰老的目的；周玮婧等[27]对莲藕节的多酚物质和抗氧化性能进行测定，发现其抗氧化活性随着多酚含量增加而增加，且纯化物的活性高于粗提物。另外，对于荸荠皮的抗氧化活性也有相关研究。李婕姝等[28]研究发现，荸荠皮多糖具有清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，其清除能力与多糖浓度呈现明显的剂量效应关系。为促进人们对水生蔬菜营养价值的了解，开展对水生蔬菜抗氧化活性研究具有重要意义。但目前有关水生蔬菜的抗氧化活性研究报道较少。

传统自由基清除试验多采用人工合成DPPH自由基清除法，清除法以测定抗氧剂对DPPH自由基517nm吸光度降低为基础，蔬菜通常含有大量的色素（如叶绿素、花青素在420nm～660nm间有最大吸收波长[29-30]），其光谱吸收对DPPH自由基517 nm吸收峰可能存在明显的光谱干扰，且DPPH自由基具有脂溶性，其测量体系是乙醇，并不适于日常饮食中摄入等自由基清除能力评价。水溶性自由基ABTS+[2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐]是一种总抗氧化能力检测试剂，其主要吸收峰位于734 nm，不易受到水生蔬菜提取物的光谱干扰，且操作简单、快速、准确性好、精密度高[31-33]。本文采用水溶性ABTS法对常见的8种水生蔬菜水提取物的抗氧化活性进行测定，水提取物可以更好模拟日常饮食对水生蔬菜的摄入，且相对于DPPH自由基，更好排除光谱干扰问题，旨在为水生蔬菜抗氧化活性研究提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水芋、茭瓜、水蕨菜、荸荠、水芹菜、海菜、莲藕、慈姑共8种水生蔬菜，样品信息见表1；ABTS、DPPH：美国Sigma公司；无水乙醇：分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；蒸馏水：云南民族大学化学与环境学院实验室自制；其余试剂均为分析纯。

UV-6000 PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；PY-101研磨机、SJIA-2012超声波细胞粉碎机：宁波市鄞州双嘉仪器有限公司；SG1200HE超声清洗器：上海冠特超声仪器有限公司；FA 2004电子分析天平：上海上平仪器公司；XZ-6G低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ABTS和DPPH标准储备液的配制

根据文献[34-36]，配制7.4 mmol/L的ABTS储备液和2.6 mmol/L的K2S2O8储备液，分别取2 mL在室温条件下混合避光保存12 h～16 h，试验时用pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液稀释，使其吸光度值为0.7±0.02（λ=734 nm），即得到ABTS工作液；将1 mg/mL的DPPH无水乙醇溶液，用无水乙醇稀释获得吸光度值为 0.7±0.02（λ=517 nm）的 DPPH 溶液，即得到 DPPH标准储备液。以上试剂均在4℃储存备用。

1.2.2 蔬菜的预处理

分别取200 g新鲜的水芋（去皮）、茭瓜、水蕨菜、荸荠、水芹菜、海菜、莲藕、慈姑可食用部分洗净，再用蒸馏水涮洗3次沥干，然后用研磨机研细，装入自封袋密封备用。

1.2.3 蔬菜水提取液的制备

准确称取2份5.0 g预处理过的样品于50 mL小烧杯中，加入20 mL蒸馏水，一份在室温下放入超声清洗器中超声浸提90 min，另一份在超声波细胞粉碎机中提取20 min，分别将两份残渣和液体全部转移到离心管中以4 000 r/min的速度离心5 min，取全部上清液进行二次离心，收集全部上清液备用。

1.2.4 反应波长的确定

分别测ABTS、DPPH和样品溶液的紫外可见吸收曲线，得到其特征吸收峰，再将样品加入到ABTS溶液中，观察其特征吸收峰的变化，确定反应测定波长。

1.2.5 反应时间的确定

在ABTS溶液中分别加入样品溶液，空白不加样品溶液，对比一定时间内吸光度值的变化，确定最佳反应时间。

1.2.6 ABTS+自由基清除试验

参考文献[37]的测定方法，并做如下修改：准确移取2.0 mL ABTS溶液，分别加入10 μL不同样品溶液，空白管用蒸馏水代替样品溶液，对照管用缓冲溶液代替ABTS工作液，室温避光放置8 min，于波长734 nm处测定其吸光度，并进行紫外可见光谱扫描。每份样品平行操作3次，计算清除率并比较其清除率的大小，清除率按下式计算：

式中：Ai为加入2.0 mL ABTS溶液与10 μL样品溶液反应的吸光度；Aj为2.0 mL缓冲溶液与10 μL样品溶液反应的吸光度；A0为2.0 mL ABTS溶液与10 μL蒸馏水反应的吸光度。

1.2.7 半数抑制率（IC50）的计算

参照1.2.6步骤，并做如下修改：在ABTS溶液中分别加入10 μL不同浓度的样品溶液，其余均不变，计算不同浓度样品溶液对ABTS+自由基的清除率。以样品的浓度对ABTS+自由基清除率作图并进行线性拟合，计算IC50值（IC50的定义是清除率为50%时所需要抗氧化剂的浓度，此抗氧化剂浓度是相当于物料的质量浓度）。

1.2.8 数据统计分析

采用Excel 2010软件计算试验数据相对标准偏差；采用Origin 8.5软件进行相关曲线拟合，得出线性方程及相关系数，进一步得到半数抑制浓度。

2 结果与分析

2.1 提取方法的选择

为更好模拟人类日常饮食对水生蔬菜的摄入，选择蒸馏水作为溶剂，利用超声和超声波细胞粉碎机两种方式进行提取，并比较其提取物清除ABTS+自由基的能力，结果如图1所示。

图1 不同提取方法提取的样品对ABTS+自由基清除率Fig.1 ABTS+free radical scavenging capacity of extraction samples from different extraction methods

由图1可知，用超声波细胞粉碎机提取的明显比超声提取的清除自由基能力强，其中只有慈姑用两种方法提取的提取液清除ABTS+自由基能力几乎相等。为了更好研究不同水生蔬菜的总抗氧化能力，本文选用超声波细胞粉碎机进行提取。

2.2 样品溶液清除自由基的紫外可见吸收光谱研究

对ABTS+、DPPH自由基溶液和样品溶液进行紫外可见吸收光谱扫描，结果如图2所示。

图2 不同溶液的UV-Vis吸收光谱图Fig.2 UV-Vis absorption spectra of different solution

ABTS+自由基溶液（图 2a）在 225、346、415、734 nm处出现4个较强的特征吸收峰，DPPH自由基溶液（图2b）在328 nm和517 nm处出现两个较强的特征吸收峰，样品溶液的紫外-可见吸收光谱如图2c所示，在200 nm～500 nm之间存在许多杂峰，这些峰与ABTS+在225、346、415nm处和DPPH 328 nm处的吸收峰存在一定的干扰作用，导致吸光度值增大，样品清除率出现负偏差；样品溶液在波长500 nm～600 nm之间随着波长的不断增加吸光度值不断减小，并且波长靠近500 nm吸光度变化特别快，因此会对DPPH 517 nm处的特征吸收峰产生一定的干扰，而在650 nm～700 nm之间水芹菜有一个吸收峰，但波长大于700 nm部分，样品溶液无吸收峰并且吸光度随波长变化特别小可忽略，因此不会对ABTS在734 nm处的吸收峰产生叠加作用，也不会产生干扰。再将样品溶液加入到ABTS+自由基溶液中，进行光谱扫描，结果如图2d所示。由图2d可知，加入样品溶液后ABTS+自由基溶液225、346 nm处的吸收峰形都有所变化，而415 nm和734 nm处的峰形没有明显变化。但是415 nm附近样品溶液吸光度值变化比较明显，也会存在波谱干扰现象。综上所述，本试验宜选择ABTS+自由基溶液进行自由基清除试验。

2.3 反应时间的影响

反应体系能否达到稳定对反应结果的影响尤为重要，它直接关系到测量结果。本文研究了反应时间对不同抗氧化剂与ABTS+自由基反应的影响，结果如图3所示。

图3 溶液吸光度值随时间增加的变化图Fig.3 The variation of solution absorbance value as the time gone

ABTS+自由基与不同抗氧化剂反应时，反应时间会存在一定的差异，但达到一定时间后反应基本达到平衡。在ABTS+中加入相同浓度的不同抗氧化剂后，ABTS在734 nm处的特征吸收峰值迅速下降，8 min后基本趋于稳定，说明开始反应至8 min这段时间，抗氧化剂清除ABTS+自由基反应的动力学速率较快，但反应8 min后基本趋于稳定，说明反应速率很慢，对结果的影响也较小（可忽略）。因此，本文选择8 min作为反应时间。

2.4 样品溶液对ABTS+自由基的清除活性

通过以上试验，在通过超声波细胞粉碎机提取样品溶液，反应波长734 nm、反应时间8 min的条件下，测定同一浓度下不同样品的清除率，结果如图4所示。

图4 同一浓度的8种提取物对ABTS+自由基的清除能力Fig.4 Scarseaging capacity of eight estracts of the same extract to ABTS+radical

水生蔬菜的抗氧化能力差别很大，其中抗氧化能力最强的是水蕨菜，最弱的是茭瓜。从图4中可知8种提取物对ABTS+自由基的清除能力依次为：水蕨菜＞莲藕＞水芋＞水芹菜＞荸荠＞海菜＞慈姑＞茭瓜。但是单一浓度下测定的抗氧化活性具有一定的局限性，不能代表所有浓度下的抗氧化活性。为更好的评价其抗氧化活性。本试验采用梯度浓度的水生蔬菜提取物清除ABTS+自由基，测定其抗氧化活性，得到清除率如图5和图6所示。

图5 3种提取物对ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scarseaging capacity of three concentration to ABTS+radical

图6 5种提取物对ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scarseaging capacity of five estract to ABTS+radical

8种提取物均对ABTS+自由基具有清除作用，从整体看，随着提取物浓度的不断增加清除作用不断增强，说明8种提取物对ABTS+自由基的清除能力存在一定的量效关系，根据量效关系进行线性拟合得到线性方程和相关系数（相关系数均大于0.995 0），进而得到IC50值，结果如图7所示。

图7 清除ABTS+自由基的IC50值Fig.7 The IC50of ABTS+scarseaging rate

8种提取物清除ABTS+自由基的IC50值分别为：海菜2.412mg/mL、水芹菜1.795mg/mL、慈姑2.932mg/mL、莲藕0.974mg/mL、荸荠2.517mg/mL、水蕨菜0.140mg/mL、茭瓜4.111 mg/mL、水芋1.594 mg/mL（此浓度是相当于物料的质量浓度）。IC50值越高说明其抗氧化能力越弱，因此抗氧化能力由弱到强依次为茭瓜、慈姑、荸荠、海菜、水芹菜、水芋、莲藕、水蕨菜。水蕨菜的半数抑制浓度（0.140 mg/mL）明显低于其他几种蔬菜，通过查阅文献可知水蕨菜中含有丰富的胡萝卜素、维生素C、氨基酸等[38]，胡萝卜素和维生素C都是强抗氧化剂，导致水蕨菜的抗氧化能力很强。此外，胡萝卜素、维生素与酚类之间存在相互协同作用也可使水蕨菜有较强的抗氧化活性[39]；而茭瓜的半数抑制浓度较高，其中茭瓜中主要以碳水化合物和粗纤维为主，维生素含量较低[19]，含抗氧化剂的种类和含量相对其它几种水生蔬菜较少，因此清除自由基能力相对较弱；水芋中也含有维生素和碳水化合物，但抗氧化能力明显强于茭白，说明水芋中的维生素、碳水化合物的种类和含量有一定差异或者水芋中还含有其它抗氧化物质；水芹菜中主要以黄酮为主[11-12]，抗氧化能力相对较强；荸荠中也含有黄酮，并且还含有维生素、多糖、多酚等[24]，但抗氧化能力比水芹菜弱，说明荸荠中抗氧化物质的含量偏低；海菜中主要含有矿物质、蛋白质、钙和磷等[40]，其抗氧化能力相对较好。慈姑则以慈姑多糖抗氧化为主。

3 结论

本文研究结果表明ABTS+自由基在734 nm处水生蔬菜提取物对ABTS+自由基反应不产生光谱干扰，避免了DPPH自由基517 nm易于产生光谱干扰问题。且ABTS+自由基具有亲水性，更适于模拟人体日常饮食对水生蔬菜的摄入等的自由基清除能力评价。根据ABTS+自由基清除试验得到这8种水生蔬菜的半数抑制浓度IC50值依次为茭瓜（4.111 mg/mL）＞慈姑（2.932mg/mL）＞荸荠（2.517mg/mL）＞海菜（2.413mg/mL）＞水芹菜（1.795 mg/mL）＞水芋（1.594 mg/mL）＞莲藕（0.974 mg/mL）＞水蕨菜（0.140 mg/mL），8种水生蔬菜均具有良好的抗氧化活性，能快速、有效的清除自由基，其中水蕨菜的抗氧化能力最强。由于水生蔬菜中成分复杂多样，其抗氧化活性表现出一定差异，此外，含量对抗氧化活性也有很大影响，需对水生蔬菜中主要成分进行抗氧化活性测定，才能得到比较科学合理的结论。