一种黑木耳酸性多糖的分离纯化及其结构鉴定

苗晶囡，邱军强，*，李海霞，张华，刘树民

（1.海南医学院药学院，海南海口570100；2.哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江哈尔滨150090；3.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150090）

黑木耳（Auricularia auricula）为属真菌类担子菌纲，是生长在朽木上的一种腐生菌，在我国作为药食同源真菌被广泛食用，主要生长于我国东北部的大、小兴安岭山区[1-2]。黑木耳的营养价值和多种药理功能引起相关学者的研究兴趣。《本草纲目》中记载：木耳生于朽木之上，性甘平，主治益气不饥，轻身强志，并有治疗痔疮，血痢，下血等作用。国内外文献报道黑木耳子实体多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）具有抗氧化[3]、降血脂[4]、降血糖[5]、抗肿瘤[6]、抗凝血[7]和抗衰老改善心肌功能等活性[8-10]。但是，截止到目前有关低分子量的黑木耳酸性多糖分离纯化及其结构研究罕见报道，通过对低分子量的黑木耳酸性多糖进行提取分离、纯化和结构鉴定研究，以期为今后黑木耳多糖的各种生物活性深入研究及开发利用提供试试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黑木耳：伊春小兴安岭林场；氢氧化钠、氯仿、正丁醇、氯化钠、无水乙醇、高碘酸、三氟乙酸、高碘酸钠、甲酸、硼氢化钠、溴甲酚、硫酸、碳酸钡、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：国药集团化学试剂有限公司；离子交换纤维素（Diethylaminoethyl-52，DEAE-52）、葡聚糖凝胶层析Sephadex G-100：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；标准单糖：美国默克公司。

N-1000型旋转蒸发仪：上海亚荣仪器有限公司；KQ-5200型超声波清洗器、FW-100型高速万能粉碎机：天津泰斯特设备有限公司；PB-10型精密pH计、R200-D型电子分析天平：德国Sartorius公司；FD-1型真空冷冻干燥机：北京博医康仪器设备有限公司；HWS-24型电热恒温水浴锅：上海一恒仪器有限公司；GL-10LM型高速冷冻离心机：湖南星科设备有限公司；TGL-16G型台式离心机：上海安亭仪器有限公司；Spectrum one FT-IR型傅里叶红外光谱仪：美国铂金埃尔默有限公司；Agilent-1100型高效液相色谱仪、Agilent 6890-5973型气质联用仪：美国Agilent公司；Bruker ultrashield-500型核磁共振仪：德国Bruker公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取及乙醇分级沉淀

称取一定量的黑木耳粉末，按照质量浓度为0.012 5 g/mL的比例加入去离子水，440 W超声处理20 min，使用100℃水浴对黑木耳多糖提取4 h，按照上述提取方法反复提取共3次。合并提取液，并通过离心机4 000 r/min条件下，离心10 min。收集上层提取液，将其在50℃条件下，通过旋转蒸发仪减压浓缩，然后向得到的浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，4℃沉淀过夜。通过离心分离得到乙醇沉淀物，将所得沉淀物依次通过乙醇、丙酮和乙醚进行清洗，一定量去离子水复溶后冻干，得黑木耳粗多糖提取物，即为“黑木耳粗多糖”。

1.2.2 Sevage法除蛋白

取步骤1.2.1所得的黑木耳粗多糖，在50℃的热水浴中，溶解干燥的粗多糖，然后通过Sevage除蛋白法去除粗多糖中的蛋白质，加入5倍体积的Sevage试剂，4 000 r/min离心20 min后，去除变性的蛋白质，重复操作3次以上，直至完全除去蛋白质成分。将除去蛋白质的上清溶液减压浓缩，加入3倍体积的95%乙醇4℃沉淀24 h，真空冷冻干燥，得到“黑木耳精制多糖”[11]。

1.2.3 乙醇分级

取步骤1.2.2所得的黑木耳精制多糖，在50℃的热水浴中，溶解干燥的精制多糖，然后通过分别加入一定体积的无水乙醇，使得多糖溶液中的乙醇体积浓度依次达到20%、40%、60%、80%，分别经过4 000 r/min离心20 min后，得到的沉淀依次为AAP-20%、AAP-40%、AAP-60%、AAP-80%和AAP-80%以上，将得到的AAP-60%作为后续研究对象[11]。

1.2.4 DEAE-52离子交换层析

准确量取20.0 g DEAE-52纤维素介质，通过适量去离子水浸泡24 h，使得纤维素介质得到充分溶胀。除去表面漂浮的颗粒，真空泵过滤吸干水分，然后通过一定体积浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液进行浸泡1 h。采用去离子水洗涤为中性，再分别配制0.5 mol/L的HCl溶液、0.5 mol/L的NaOH溶液，并对介质进行活化处理，备用。本试验采用规格为2.6 cm×60 cm的玻璃层析柱，径长比为1∶20，上样体积为15 mL。采用不同浓度的NaCl溶液对其进行洗脱，依照0～1 mol/L的浓度变化进行逐步洗脱，洗脱流速设定为0.5 mL/min，采用自动收集器不同阶段的洗脱液，按每管10 mL进行收集，通过苯酚硫酸法对洗脱馏分进行分析[12]。

1.2.5 Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析

精确量取30.0 g的葡聚糖凝胶Sephadex G-100，取一定体积的去离子水对介质进行溶胀48 h，弃去溶液中的悬浮颗粒。按照葡聚糖凝胶的理化性质，选择玻璃层析柱的尺寸为3.0 cm×100 cm，上样体积为15.0 mL，上样浓度设定为 1.0 mg/mL，径长比为 1∶18，以蒸馏水作为洗脱液，洗脱流速设置为0.5 mL/min。将离子交换层析分离获得的多糖样品再通过葡聚糖凝胶层析进行分离，自动收集器对洗脱馏分进行收集，每管10 mL，采用苯酚硫酸法对洗脱液进行分析[13]。

1.2.6 黑木耳多糖的特性黏度及黏均分子量测定

精确称取适量黑木耳多糖样品，室温将其溶解于一定体积蒸馏水中，0.22 μm滤膜过滤，将规格为0.5 mm～0.6 mm的乌氏黏度计置于水浴装置中保持温度恒定为25℃，通过梯度稀释的方法测量多糖溶液和水在黏度计中的流出时间，每个样品同一浓度重复测量3次。特性黏度[η]的值根据哈金斯（Huggins）方程计算得到[14]，同时根据马克霍温克方程特性推导黏均分子量。

式中：c为样品的浓度，g/mL；K为哈金斯常数，单位；η为样品的特性黏度，dL/g。ηsp为样品的增比黏度。

1.2.7 黑木耳多糖的红外光谱分析

准确称取5.0 mg的AAP，然后将其分别与76 μm的KBr粉末300.0 mg进行混合，在红外灯下用玛瑙乳钵进行研磨，将混合物装入到压片模具中，在抽真空条件下用油压机以27 MPa的压力进行压片，在4 000 cm-1～400 cm-1处进行红外光谱扫描。

1.2.8 黑木耳多糖的高效液相色谱分析

将得到的多糖用流动相配制成2 mg/mL的溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱示差检分析，进样量为20 μL。Waters高效液相色谱系统（2996泵，2414示差检测器），Shodex sugar KS-805+保护柱KS-G高效凝胶过滤色谱柱，流动相为超纯水，柱温30℃，流速0.8 mL/min。进行高效液相色谱法测定，记录色谱图。

1.2.9 黑木耳多糖的单糖组成分析

单糖液相工作液的制备：依次精确称取7种单糖对照品（L-鼠李糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-核糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-甘露糖）各0.100 2 g，使用去离子水依次定容至100 mL。依次吸取单糖工作液0.25、0.50、2.50、5.00、10.00 mL，移入 10 mL 棕色容量瓶中，去离子水定容，最后得到终浓度依次为0.025、0.050、0.250、0.500、1.000 mg/mL的单糖标准工作液。

多糖样品水解过程如下：将多糖（15.0 mg）置于4 mL浓度为2 mol/L的三氟乙酸溶液中，通入氮气，立即进行试管封口，110℃条件下水解4 h。然后等待试管冷却至常温，将水解液在50℃以下减压浓缩蒸干，然后用3 mL甲醇对样品进行溶解，氮气吹干，对上述操作进行重复4次～5次，从而彻底去除三氟乙酸。

单糖乙酰化：通过3 mL的蒸馏水将多糖的水解产物或单糖混标溶液进行溶解，接着通过加入30.0 mg硼氢化钠还原3 h，在还原过程中保证间歇震荡，促使反应完全。待反应完全结束，吸取几滴冰醋酸滴加到反应液中，使得上述溶液中没有气泡，然后弃去过量的硼氢化钠，通过旋转蒸发器50℃左右将反应液减压蒸干，通过4 mL的甲醇进行溶解，接着采用氮吹设备除去甲醇，反复进行上述操作4次～5次，完全除去硼酸根。将样品置于110℃烘箱中30 min，从而脱去样品中的水分。冷却至室温后滴加3 mL乙酸酐和1 mL的吡啶，在100℃高温条件下反应3 h～5 h，待沉淀完全消失后，使用旋转蒸发器80℃将反应液减压蒸干，然后滴加5 mL氯仿定容。并加入相同量的去离子水洗涤2次～3次，弃去多余的乙酸酐，最后放入无水硫酸钠脱去水分，0.45 μm滤膜过滤，上机。

色谱条件为色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序设置：初始200℃，25℃/min至 250℃，持续 10 min；载气：He；进样量：1 μL；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃，分流比：1∶10。

质谱条件：轰击源：EI；电子能量：70 eV；倍增器电压：350 V；接口温度：250℃；离子源温度：150℃；四级杆温度：230℃；扫描范围：35 amu～450 amu，AAP 质谱库检索加以分析[15]。

1.2.10 黑木耳多糖的高碘酸氧化—Smith降解反应

取45.0 mg样品，加入10 mL双蒸水溶解，接着加入30 mmol/L NaIO412.5 mL，加入双蒸水定容至25 mL，使得NaIO4终浓度为15 mmol/L，然后置于避光处反应，每隔6 h取样0.1 mL，然后加入双蒸水稀释250倍，并以双蒸水作为空白对照，于223 nm波长处测定吸光度，待吸光度值达到恒定时，加入乙二醇终止反应，高碘酸氧化反应完成，计算高碘酸的消耗量。

式中：c为样品的浓度，g/mL；V为体积，mL。

取2 mL上述反应得到的高碘酸氧化液，加入1滴溴甲酚（红）紫作为指示剂，加入0.006 mol/L的NaOH（邻苯二甲酸氢钾标定）进行滴定，计算反应中的甲酸生成量。

式中：c为样品的浓度，g/mL；V为体积，mL。

将乙二醇处理后的反应液进行透析，分别通过流动水和蒸馏水透析24 h。然后将袋内溶液进行减压浓缩，接着加入NaBH4进行还原过夜。然后加入50%甲酸将pH值调整至6～7之间，通过流动水与蒸馏水各进行透析24 h。将其中的1/3部分（Ⅰ）干燥后用于气质联用色谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）GC-MS分析，剩余部分进行Smith降解。通过加入同样体积的1 mol/L H2SO4，将混合液于25℃水解40 h，通过BaCO3溶液将pH值调整至6左右。过滤溶液，将滤液置于蒸馏水中进行透析48 h，将透析液的袋外部分（Ⅱ）进行干燥，然后进行GC-MS分析，透析液的袋内部分通过乙醇进行醇沉，接着离心分别得到上清部分（Ⅲ）和沉淀部分（Ⅳ），将上述样品进行干燥后，分别进行GC-MS[15]。

1.2.11 黑木耳多糖的甲基化分析

将多糖样品20 mg溶于10 mL水中，然后加入N-环已基-3-（2-吗林代已基）碳二亚胺对甲苯黄酸盐（C.M.C）300 mg，然后滴加 0.01 mol/L HCl，将 pH 值调整为4.75，维持2 h。接着加入2 mmol/L硼氢化钠溶液（20 mL），用4 mol/L HCl调整pH值为7.00，持续搅拌。NaBH4加完后，室温下继续反应l h，用蒸馏水对反应液进行透析，将透析内液减压浓缩至10 mL，冷冻干燥。上述还原反应通常进行2次～3次，取少量样品进行完全水解进行薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）分析，以确定还原是否完全[16-17]。

①多糖溶解：称取约20 mg AAP样品，溶于6 mL DMSO中，充N2后立即用封口膜封管，室温磁力搅拌过夜，至充分溶解。

②NaOH-DMSO混悬液的制备：将240 mg完全干燥的NaOH与6 mL DMSO混合，充N2后立即用封口膜封管，25℃磁力搅拌，过夜，使其充分混匀。

③甲基化：将6 mL NaOH-DMSO混合液加入已充分溶解的糖样中，充N2，封管，磁力搅拌1 h，冰浴5 min，待反应液体完全冷冻后，冰水浴条件下缓慢滴加3.6 mL碘甲烷，密封，磁力搅拌，反应液逐渐解冻，澄清，直至成为亮黄色溶液。恢复至室温，继续搅拌30 min，完毕，加水中止反应，减压除去碘甲烷（＜30℃），自来水和蒸馏水分别透析24 h。透析内液冷冻干燥。重复上述过程3次～4次。

④萃取甲基化多糖：将上述反应液浓缩至10 mL左右，加入等体积氯仿，充分振荡30 min萃取甲基化多糖，收集下层的氯仿层，重复3次，合并萃取液。蒸馏水洗涤萃取液3次，接着加无水Na2SO4至没过液面，干燥24 h。过滤，减压浓缩氯仿至1 mL左右。取适量做红外光谱检查。

⑤红外光谱（infrared spectroscopy，FT-IR）检查：如图谱在3 400 cm-1处无吸收峰，则证明多糖甲基化完全。

⑥水解：完全甲基化的多糖真空干燥后，加90%甲酸2 mL，充N2封管，100℃水解6 h，然后加甲醇去除甲酸，至pH值为6～7，真空干燥，再加入2 mol/L三氟乙酸3 mL，密封，110℃水解2 h，然后用甲醇赶除三氟乙酸至中性，水解后的产物用2.0 mL水溶解。

⑦还原：加入NaBH460 mg还原3 h，室温磁力搅拌；然后加入两滴醋酸分解过量的硼氢化钠至无气泡产生。溶液减压浓缩至干，加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥。

⑧乙酰化：加乙酸酐2 mL，封管，100℃乙酰化2 h，减压蒸干以除去多余的醋酸酐，然后加入1 mL氯仿萃取，反复3次。萃取液再减压蒸干，无水Na2SO4干燥24 h，过滤。

⑨样品分析：产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：采用Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，配备DB-17毛细管柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm，程序升温，柱温 90℃，保持 1 min，以5℃/min至200℃，以2℃/min至210℃，以10℃/min至270℃，保持1 min，氦气作载气，进样口温度270℃，分流比 1∶1，柱流速 1.0 mL/min，EI（70 eV），接口温度230℃，离子源温度 200℃，扫描范围：m/z 43～500，扫描速率：2.5 scan/s[17]。

1.3 统计分析

采用SPSS16.0软件通过单因素方差分析和Duncan's多重比较法进行数据统计分析，p＜0.05为差异性显著，p＜0.01为差异性极显著。所有的数据以平均值±标准差进行表达，通过Origin 9.0对数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 黑木耳多糖的提取及乙醇分级沉淀

分别通过乙醇分级、DEAE-52离子交换柱和Sephadex G-100对黑木耳多糖进行梯度洗脱，其中DEAE-52离子交换柱、Sephadex G-100和高效液相色谱的洗脱曲线分别见图 1（A）、（B）和（C）。结果均显示该多糖为单一峰，其他梯度没有洗脱峰，同时通过高效液相色谱仪测定发现其呈现单一对称峰，表明该多糖为均一多糖。通过减压浓缩冷冻干燥得到多糖冻干粉。

2.2 黑木耳多糖的特性黏度与黏均分子量

利用乌氏黏度计通过梯度稀释法对得到的黑木耳多糖特性黏度进行分析。根据Huggins方程，通过计算[ηspecificviscosity/c]的数值对浓度c作图得到特性黏度为4.4 dL/g；通过公式[η]=kMa（式中：k为哈金斯常数；Ma为黏均分子量），由特性黏度推算得到AAP的黏均分子量为4.50×103Da。

图1 黑木耳多糖离子交换柱（A）、葡聚糖凝胶柱洗脱曲线（B）和高效液相色谱图（C）Fig.1 Elution cure of AAP on DEAE-cellulose ion exchange colum（A），Sephadex G-100（B）and HPLC（C）

2.3 黑木耳多糖的红外谱图分析

红外光谱属于分子吸收光谱，通过将频率连续变化的红外光照射到样品上，一些特定波长的红外射线被吸收，从而形成该样品的红外吸收光谱。由于化合物组成和结构的不同，因此每一个化合物分子就具有独特的红外吸收光谱。因此可以通过红外光谱对未知化合物的结构进行初步分析和鉴定。

黑木耳多糖进行红外谱图见图2，具体特征峰和官能团数据见表1。由图2中可以看出，得到的黑木耳多糖的FT-IR光谱具有明显的多糖特征吸收峰。在FTIR光谱中（表1），黑木耳多糖片段的特征性吸收峰均主要包括 3 429 cm-1、2 938 cm-1、1 614 cm-1、1 424 cm-1、1 145 cm-1、1 096 cm-1、821 cm-1和 819 cm-1。3 500 cm-1～3 300 cm-1处出现了一宽峰，是O-H伸缩振动吸收峰，说明存在分子间和分子内氢键，其中3 429 cm-1处振动峰对应于O-H伸缩振动；在3 000 cm-1～2800 cm-1之间的2 938 cm-1处振动峰则对应于C-H伸缩振动。

1 606 cm-1～1 618 cm-1之间的 1 614 cm-1处振动峰（C=O非对称伸缩振动）、1 424 cm-1处振动峰（C=O对称伸缩振动）是糖醛酸中质子化羧基特征峰。1145cm-1，1 091 cm-1～1 096 cm-1也是糖醛酸的特征峰。多糖在821 cm-1处有吸收，显示α-糖苷键的存在。

图2 黑木耳多糖的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectrum of AAP

表1 AAP的红外光谱特征峰Table 1 FT-IR characteristic peak of AAP

2.4 黑木耳多糖单糖组成比例分析

单糖组成与分子量构成了多糖的一级结构，其与多糖的生物活性密切相关，通过将多糖样品酸完全水解成单糖，进而通过GC-MS依据单糖标准品保留时间分析多糖链的单糖组成。黑木耳多糖单糖组成比例见表2。

表2 AAP的单糖组成Table 2 The percent of monosaccharide of AAP %

如表2，可以看出由鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成AAP，其中半乳糖为主要单糖，占63.2%，其次是葡萄糖和半乳糖醛酸，分别占17.1%和10.4%，然后是D-甘露糖占3.1%，所占比例最低的为L-鼠李糖和D-木糖，各占0.3%。

2.5 黑木耳多糖的高碘酸氧化—Smith降解分析

高碘酸氧化作为一种选择性氧化反应，其只作用于多糖分子中连二羟基或连三羟基。其中前者中的碳-碳键能够被氧化断开形成相应的醛，而后者中的碳-碳键则被氧化断开后生成甲酸和对应的醛，因此可通过高碘酸消耗量和甲酸生成量对糖苷键的位置、直链多糖的聚合度与支链多糖的分支数量进行分析。而Smith降解主要针对被高碘酸破坏的糖苷键进行断裂，而未被高碘酸氧化的糖残基仍然连接在糖链上，从而通过对降解产物进行分析来推测多糖糖苷键的键型和所在位置。

高碘酸氧化反应结果见表3，AAP氧化过程中出现了甲酸，表明AAP中存在1→或1→6键型，高碘酸的消耗量多于甲酸的生成量的2倍，表明多糖中还存在其他连接方式，如1→2、1→2，6、或1→4键型或1→4，6键型等。多糖中平均每摩尔己糖残基释放0.67mol/L的甲酸，说明每10个己糖残基平均有6.71个非还原末端或者1→6糖苷键。

表3 AAP的高碘酸氧化结果Table 3 The result perriodate oxidation of AAP

通过高碘酸氧化后进行完全酸水解，然后对经乙酰化获得的各衍生物进行GC-MS分析，分析结果见表4。结果表明通过高碘酸氧化后产物经完全酸水解检测出甘露糖，表明AAP中有不被高碘酸氧化的键型，如 1→3、1→3，4、1→3，6、1→2，4 键型等；而袋外部分和袋内上清中检测得到葡萄糖、甘露糖和木糖，说明其存在不被高碘酸氧化的键型且位于支链或靠近主链的支链上。袋内沉淀存在葡萄糖、甘露糖和半乳糖，表明主链中的葡萄糖、甘露糖和半乳糖存在不被高碘酸氧化的 1→3、1→3，4、1→3，6、1→2，3、1→2，3，4等键型。

表4 AAP的Smith氧化降解产物气质分析结果Table 4 GC-MS analysis results of AAP fractions after Smith degradation

2.6 黑木耳多糖的甲基化分析

甲基化分析为糖链连接次序分析的一种重要手段，在多糖结构化学及仪器分析方法中比较常用。其中把多糖中单糖残基包含的游离羟基完全甲基化为甲基化机理，然后把多糖的糖苷键水解，水解后所得到的化合物中羟基的归属位置就是原多糖中单糖残基的连接位点。可以通过计算甲基化单糖的比例，来推测连接键的类型在多糖结构中所占的比例。

通过该方法获得的羟基，还包括用NaBH4还原醛基而产生羟基，然后乙酰化来制备得到经过甲基化反应的糖醇乙酸酯（该化学物质容易挥发，因此需要通过GC进行分析），最后通过GC-MS分析，依照气相色谱图中峰的相对保留时间和质谱谱图的离子碎片结果可以准确地确定糖的连接键型[18]。

AAP的甲基化分析结果见表5和表6，由于鼠李糖、木糖和半乳糖醛酸的含量很低，在GC-MS分析过程中并没有被检测到，AAP中的葡萄糖以1→2、1→3、1→6键型存在；甘露糖以1→3、1→6键型存在；半乳糖以1→、1→6键型存在。由此确定了AAP中各个单糖的连接方式。综合上述分析结果和文献报道[16-17]，推测 AAP（V）中含有→6）-α-D-Galp-（1→、-Manp-（1→、→3，4）-α-D-Manp-（1→、→3）-α-D-Manp-（1→和→6）-α-D-Glcp-（1→等残基。

表5 AAP的糖苷键分析结果Table 5 The result of glycosidic bonds analysis of AAP

表6 AAP的甲基化分析结果Table 6 The result of methylation analysis of AAP

3 结论与讨论

多糖作为一类由单糖缩合而成的高分子聚合物，其分离纯化方法主要有季铵盐沉淀法、分级沉淀法、金属盐沉淀法、电渗析法、透析法、膜分离法和色谱分离法等，目前一般采用DEAE-纤维素或其他各种不同种类的凝胶柱层析以及离子交换色谱法。本文采用离子交换纤维素DEAE-52及葡聚糖凝胶层析Sephadex G-100分离得到一种黑木耳酸性多糖，采用乌氏黏度计法、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化分析等化学分析方法和紫外、红外、HPLC、GC-MS等仪器分析方法对其单糖组成和结构进行初步鉴定，取得了较好的结果；以往科研人员大多从黑木耳中提取得到的多糖其相对分子质量较大，而本试验从黑木耳子实体中得到的AAP相对分子质量为4.50×103Da，因此为黑木耳多糖的研究与开发利用提供了一定基础和理论依据。

本文采用水提醇沉法、Sevage法脱蛋白，从黑木耳中提取黑木耳多糖。通过乙醇分级、离子交换纤维素DEAE-52及葡聚糖凝胶层析Sephadex G-100对AAP进行纯化，发现AAP为一种具有高分支结构的葡聚糖，通过乌氏黏度计法测定黏度，并通过公式[η]=kMa计算得到AAP的黏均分子量为4.50×103Da，采用红外光谱（FT-IR）、高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）对其主要组分的理化性质和化学结构进行分析，结果表明其所含鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖的百分比为 0.3∶17.1∶0.3∶3.1∶63.2，通过进一步对AAP甲基化分析，并对其糖残基的连接方式进行分析，AAP 中含有→6）-α-D-Galp-（1→、-Manp-（1→、→3，4）-α-D-Manp-（1→、→3）-α-D-Manp-（1→和→6）-α-D-Glcp-（1→等残基。