亮氨酸对早期断奶湖羊瘤胃发育及细菌菌群的影响

孙施杰，王 羽中，茅慧玲

（浙江农林大学动物科技学院，浙江临安 311300）

早期断奶可促进羔羊瘤胃发育、满足补偿性生长以及提高母羊的繁殖率等[1-2]。然而早期断奶时羔羊易出现“应激综合征”，尤其是胃肠道的氧化应激会使羔羊出现“生长性休克”或负增长，导致成活率和育成率降低。亮氨酸作为动物的必需氨基酸，除参与哺乳动物蛋白质合成和骨骼肌蛋白质周转调节、肠道发育调节外[3-5]，还是一种有效的抗氧化物质，可以有效缓解氧化应激，维持机体抗氧化系统的平衡[6]。胡军等[7]研究报道，添加亮氨酸可以降低早期断奶仔猪肠道的活性氧水平。因此推测，新生羔羊补饲亮氨酸可促进瘤胃的早期发育，促进瘤胃微生物区系的建立，减缓早期断奶应激引起的氧化损伤，从而提高生产性能。本研究利用高通量测序技术探讨亮氨酸对早期断奶湖羊羔羊瘤胃细菌菌群组成以及瘤胃发酵的影响，从瘤胃微生物角度研究亮氨酸对瘤胃发育影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计 选取出生5 d 健康无疾病的湖羊羔羊36只，根据体重、出生日期相同或相近的原则，按照亮氨酸的添加量不同随机分为对照组（C，0 g/d）、低剂量添加组（L，0.66 g/d）和高剂量添加组（H，1.33 g/d），每组4 个重复，每个重复3 只羔羊。羔羊饲喂代乳粉，每天饲喂3 次，自由采食；经5 d 适应环境和代乳粉后，于10 日龄开始正式试验，饲喂代乳粉的同时补喂开食料及羊草。代乳粉的饲喂量为每天780 mL/ 只（根据适应期代乳粉的采食量确定），为促进开食料和羊草的采食，代乳粉每天减少30 mL/ 只至210 mL/ 只时，维持此饲喂量不变直至30 日龄断奶。亮氨酸溶解在70 mL代乳粉中，于每天晨饲时通过灌喂的方式添加1次。

羔羊在30 日龄断奶当天，根据平均体重和平均日采食量每个重复取1 只羔羊进行屠宰。在瘤胃颅腹囊的中心采集1 m3左右的瘤胃组织样品，保存在30% 的福尔马林溶液中。瘤胃内容物部分保存于-20 ，用于测定瘤胃发酵参数，另一部分保存于-80 ，用于提取DNA，测定瘤胃细菌的多样性。

表1 代乳粉、开食料及羊草营养成分① %

1.2 试验日粮 试验日粮由代乳粉、开食料（杭州思我特农业科技有限公司）和羊草组成，其营养成分见表1。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 瘤胃组织形态 瘤胃组织样品采用酒精脱水（50%、70%、80%、95%、100% 酒精脱水30 min，100% 酒精脱水15 min），脱水后组织转移至二甲苯透明2 h 后石蜡包埋，切成5 μm 厚的切片，进行苏木精-伊红染色法。光学显微镜（Leica，美国）下的每张切片随机选10 个典型视野，使用Motic Image Plus 2.0 软件（厦门，中国）测定瘤胃乳头长度和宽度。

1.3.2 瘤胃发酵参数 挥发性脂肪酸（VFA）：采用气相色谱法测定瘤胃内容物VFA 浓度。取约2 g 瘤胃内容物置于10 mL 无菌PBS 中震荡悬浮洗涤，13 000×g 4 离心15 min，取上清液，每1 mL VFA 样品中加入20 μL 85%～90% 正磷酸，按照上述方法再次离心，取上清液，采用气相色谱（GC-8A；岛津公司，京都，日本）测定乙酸、丙酸和丁酸的浓度，进样量为2 μL，注射器/ 检测器的温度为260 ，柱温为220 ，载气为高纯氮[8]。

氨态氮（NH3-N）浓度：取约2 g 瘤胃内容物置于10 mL 无菌PBS 中震荡悬浮洗涤，取5 mL 于3 500～4 000 r/min 离心10 min，取上清，采用冯宗慈等[9]方法，使用氯化铵作为标准品，用酶标仪测定700 nm 波长条件下上清中NH3-N 浓度。

微生物蛋白：取约2 g 瘤胃内容物置于10 mL 无菌PBS中震荡悬浮洗涤，取8 mL，4 20 000×g 离心20 min，去上清。采用嘌呤法，以酵母RNA 作为标准品，使用紫外分光光度计（Beckman，DU 640）测定在260 nm波长条件下微生物蛋白含量。

1.3.3 瘤胃细菌多样性

1.3.3.1 DNA 提 取 参 照 Gagen 等[10]的 珠 磨 法 提 取DNA。所有DNA样品用Qubit2.0（Invitrogen）测定浓度。

1.3.3.2 细菌16S rRNA 基因序列扩增 16S rRNA 基因序列扩增采用341F/806R 通用引物[11]：上游为5'-ACTCCTA CGGGRSGCAGCAG-3'；下游为 5'-GGACTACVVGGGTA TCTAATC-3'。为区分每个不同的样本，在通用引物的上游序列中随机添加8 个核苷酸碱基的序列标签，即Barcoded-tag，形成Barcoded 融合引物。PCR 反应条件：95 预变性 5 min；95 变性 40 s，55 退火 40 s，72 延伸 1 min，共 30 循环；72 延伸 7 min。

1.3.3.3 Illumina HiSeq 测序及下机数据分析 Illumina-HiSeq 测序及数据分析委托上海锐翌生物科技有限公司完成。测序后首先对原始数据拼接（PANDAseq 软件）和质控（去除平均质量低于20 的reads，去除reads含N 碱基数超过3 个的reads）得到Clean reads；采用Usearch软件在97% 相似度下进行聚类以及嵌合体过滤从而得到OTU；对每个样品的Reads 进行随机抽平处理，并提取对应的OTU 序列；采用Qiime 软件做Alpha 多样性指数的稀释曲线，根据稀释曲线选择合理的抽平参数；从Qiime 软件分析抽平后的OTU 中分别提取1条Read 作为代表序列，使用RDP 方法，将该代表序列与16S 数据库比对，对每个OTU 进行物种分类；归类后，根据每个OTU 中序列的条数，得到OTU 丰度表，最后根据该OTU 丰度表进行后续分析。微生物各门属和OTU 需在每个处理组的至少3 只羔羊中出现。

1.4 统计分析 用SAS 8.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，正交多项式比较不同水平亮氨酸的作用（线性或二次），差异显著时用Duncan's 作多重比较。以P≤0.01 表示为差异极显著，P≤0.05 表示为差异显著，以 0.05＜P≤0.10 表示差异有趋势。

2 结果与分析

2.1 添加亮氨酸对羔羊瘤胃组织形态的影响 由图1 可见，日粮添加亮氨酸可以增加羔羊瘤胃乳头的长度。由表2 可见，瘤胃乳头长度随着亮氨酸添加量的增加而增加，且在C 组与H 组达显著水平（线性，P＜0.01）；添加亮氨酸可使瘤胃乳头宽度有增加趋势，但3 组间无显著差异（线性，P＞0.05）。

2.2 添加亮氨酸对羔羊瘤胃发酵参数的影响 由表2 可见，亮氨酸可使瘤胃总挥发性脂肪酸（TVFA）水平显著提高（二次，P=0.05），但未改变乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比例（P＞0.05）。与C 组相比，L 与H 组的瘤胃NH3-N 浓度均显著降低（线性，P＜0.05；二次，P＞0.05）， 分别降低 43.0% 和 36.7%， 且 L 组羔羊瘤胃内容物中微生物蛋白浓度显著高于C 组（二次，P=0.05）。

2.3 添加亮氨酸对羔羊瘤胃微生物多样性的影响

表2 添加亮氨酸对羔羊瘤胃组织发育及发酵参数的影响

2.3.1 微生物多样性分析 下机序列经拼接、优化、质控后共得到566 213 条优质序列，平均每个样品47 184条（±4 391 条）。共获得343 个OTU，平均每个样品148 个（±22 个）。样品稀释曲线如图2 所示，Good's coverage 在0.99 以上，因此，本试验测序深度能够准确反映湖羊瘤胃微生物组成。

由表3 可见，3 组羔羊瘤胃内容物的OTU 个数、Shannon 指数和Simpson 指数均差异不显著（P＞0.05）。

由图 3 可见，3 组 OTU 数共有 164 个，C、L 和H组特有的OTU 数分别为24、29、43 个。

2.3.2 添加亮氨酸对羔羊瘤胃物种分类的影响 瘤胃细菌门分类图显示（图4），瘤胃内细菌主要归于厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria） 和变形菌门（Proteobacteria）四大类。3 个处理组瘤胃内微生物种类存在差异（表4），L 组瘤胃内最多的是厚壁菌门（49.5%），H 组拟杆菌门（51.4%）显著高于L、C 组（二次，P=0.05）。

表3 97%相似性水平下物种丰富度和多样性指数

表4 羔羊瘤胃内容物中微生物门水平（＞0.1%）相对丰度

由表5 可知，各组均以普雷沃氏菌属、欧陆森氏菌属、小杆菌属和瘤胃球菌属为优势菌属，且普雷沃氏菌占比例最多。H 组的普雷沃氏菌属最多，达41.4%；与C 组相比，L 组的双歧杆菌属（ 二次，P＜0.05）、光岗菌属（二次，P＜0.05）和巨型球菌属显著增加（二次，P＜0.01）；梭菌属随着亮氨酸的添加而降低，且在C 组与H 组达显著水平（线性，P＜0.05）。各组间欧陆森氏菌属、拟杆菌属、纤维杆菌属、小杆菌属、瘤胃球菌属、琥珀酸菌属等相对含量无显著差异（P＞0.05）。

3 讨 论

瘤胃上皮约有25 万个瘤胃乳头，可使黏膜表面积扩大6～7 倍，从而通过增加瘤胃上皮与瘤胃内容物的接触面积来增加瘤胃上皮对营养物质的吸收和离子转运[12]。因此可通过瘤胃乳头的发育状况（长度和宽度）来衡量瘤胃发育状况[13]，而瘤胃微生物发酵固体饲料产生的VFA 是刺激瘤胃乳头发育的主要原因[14]。本研究显示，添加亮氨酸虽然对乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比没有影响，但可显著增加TVFA 浓度，这部分结果与添加亮氨酸增加瘤胃乳头长度的结果较为一致。亮氨酸增加TVFA 的主要原因与开食料采食量（123 g/d vs131 g/d vs 95.2 g/d，未发表数据）的变化有关。另一方面，L组羔羊消化道和瘤胃的重量与C 组相比分别提高47.4%和38.6%（未发表数据），表明添加适量亮氨酸可促进羔羊消化道和瘤胃的发育，有利于营养吸收。

表5 羔羊瘤胃内容物中微生物属水平（＞ 0.1%）相对丰度

瘤胃液中的NH3-N 是瘤胃氮代谢过程中内源含氮物质和外源蛋白质降解的重要产物，同时也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料。一般情况下，瘤胃NH3-N 水平呈现一个动态平衡状态，但影响瘤胃NH3-N浓度的因素较多，主要包括饲料蛋白的降解程度、氮的摄入量、瘤胃对NH3-N 的吸收以及瘤胃微生物合成微生物蛋白的速度。本研究发现，添加亮氨酸可以降低瘤胃NH3-N 浓度，增加瘤胃微生物蛋白含量。推测可能的原因是亮氨酸作为一种氨基酸可以促进瘤胃内蛋白分解菌的生长，从而提高瘤胃细菌对含氮物质的降解，提高菌体蛋白合成的底物水平，最终增加瘤胃微生物蛋白的含量。后续可通过测定瘤胃蛋白分解菌的变化验证这一推论。

肠道菌群主要由厚壁菌门（35%～80%）和拟杆菌门（17%～60%）构成[15]。本试验中厚壁菌门和拟杆菌门是各组羔羊瘤胃细菌丰度最高的菌群，与前人的研究结果较为一致。普雷沃氏菌属是瘤胃内容物中丰度最高的菌属[16]，该菌属是含有丰富高效的水解淀粉和蛋白质的菌种[17]。双歧杆菌属是糖类分解菌[18]，尤其在饲喂高淀粉日粮的瘤胃中大量存在。因此，普雷沃氏菌属和双歧杆菌属相对丰度变化受采食量的影响较大，然而L组普雷沃氏菌属丰度较H 组显著降低，这一结果与固体开食料采食量呈相反趋势，说明在本试验中亮氨酸对普雷沃氏菌属丰度的影响并非取决于饲料的摄入量，具体的作用机理有待进一步研究。巨型球菌属中的埃氏巨型球菌是瘤胃中提供支链VFA 的重要来源[19]。有研究发现，在新生奶牛日粮中补饲埃氏巨型球菌NCIMB41125 能够提高犊牛的生长性能，增加瘤胃内丁酸浓度、瘤胃上皮乳头宽度和密度，表明埃氏巨型球菌NCIMB41125 能通过促进瘤胃代谢、增加代谢产物的吸收来促进瘤胃的发育[20]。因此，瘤胃埃氏球菌属相对丰度的增加在瘤胃发育中可能起重要作用。光岗菌属具有很强的发酵碳水化合物的能力[21]，其终产物是乙酸和琥珀酸。添加低剂量的亮氨酸可以增加该菌属的丰度，但是高剂量反而没有显著影响，原因还有待进一步研究。

4 结 论

本试验中，灌喂亮氨酸对早期断奶羔羊的瘤胃细菌丰富度和多样性没有影响，但可以改变细菌组成（如瘤胃埃氏球菌属和光岗菌属的相对丰度增加），从而影响瘤胃发酵，增加羔羊瘤胃TVFA 含量，降低NH3-N 浓度，提高微生物蛋白浓度，促进瘤胃的发育，减少断奶应激，且亮氨酸添加量以0.66 g/d 效果更为显著。