超排前有腔卵泡数对青年和牛体内胚胎生产效率的影响

赵明礼 ，郝少强 ，王 娜 ，郭 晶 ，郭春明 ，许彩华 ，于 清 ，李 娇 ，王小武 *，马 毅

（1.天津中科博雅生物育种研究有限公司，天津 300347；2.天津梦得集团有限公司，天津300400；3.全国畜牧总站，北京 100193；4.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

和牛是国际公认品质最优良的肉牛品种，引入中国后多以杂交改良的方式进行商业推广，缺乏系统性的繁育体系，导致纯种存栏量低，杂交品种繁杂。超数排卵-胚胎移植又称体内胚胎生产，是发展最早、应用最广的胚胎生物技术，是良种肉牛快速扩繁的有效技术手段[1]，对我国和牛产业发展具有重要意义。国内外学者针对体内胚胎生产技术开展了大量研究，主要围绕在激素种类、供体年龄、超排季节、处理频次等方面[2-4]，但在供体牛筛选标准上的研究较少。近年来，国外学者指出血液中抗缪勒管激素可以用来预测超排效果[5]，这在国内也得到了验证[6]。但对于大多数牧场而言，测定血液中抗缪勒管激素浓度需要借助第三方检测公司，具有不可控性、费用高及检测周期长等缺陷，因此，不适宜作为商业化体内胚胎生产供体牛的筛选标准。随着超声影像技术在牛场的广泛应用，通过B超检查卵巢上的有腔卵泡数可以更直观反映供体牛的卵巢活性。目前，国内尚无卵泡数对供体牛超排效果影响的相关报道。本实验通过B超检查超排前供体牛两侧卵巢上直径为3～5 mm的有腔卵泡数，研究有腔卵泡数对超排效果的影响，以期优化体内胚胎生产供体牛筛选标准，为建立和牛高效扩繁技术体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验母牛为天津中科博雅生物育种研究有限公司良繁场提供的16～18月龄青年黑毛和牛（Fullblood Wagyu），所有牛只系谱信息完整，发情周期正常，体况适中，经直肠检查生殖器官正常，无繁殖疾病。精液为内蒙古赛科星精源科技有限公司同批次生产，经抽检，符合国标《牛冷冻精液》（GB 4143-2008）质量要求。

1.2 试剂 维生素ADE（5 mL/支，维生素A 25万单位+维生素D 2.5万单位）为西乡长江动物药品有限责任公司生产；氯前列烯醇（PG，0.322 mg/支）为齐鲁动物保健品有限公司生产；孕酮阴道栓（CIDR，1.56 g孕酮/支）、促卵泡素（FSH，Folltropin-V，稀释后20 mL/瓶，含NIH-FSH-P1 20 mg/mL）、冲胚液（Flush）、保存液（Holding）均来自于法国Vetoquinol公司；促黄体素释放激素（LHRH-A3，促排3号，25 μg/支）为宁波市三生药业有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 选择68头青年黑毛和牛作为供体，超排处理前使用兽用B超（型号Easi-Scan Micro-Convex，英国BCF公司）检查两侧卵巢上直径为3～5 mm的有腔卵泡数，以卵泡总数10和20为临界值将其分为3组，I、Ⅱ、Ⅲ组有腔卵泡数分别为＜10、10～19、≥20个（表1）。

表1 不同组间供体牛超排前有腔卵泡数

1.3.2 超排处理及人工授精 采用CIDR+FSH+PG的超排方法，即在供体牛发情间期的任意一天上午埋植孕酮阴道栓（CIDR）（埋植当天计为第0天），并肌肉注射2支维生素ADE，第5天到第8天连续在每天07:00、19:00分2次肌肉注射促卵泡激素（FSH），4 d的剂量分别为2、1.5、1、0.5 mL/次（总剂量10 mL），第7天上午注射FSH的同时，注射2支前列腺素（PG），下午注射FSH的同时，注射1支PG并撤出CIDR。第9天观察发情，供体发情后8～12 h进行第1次人工授精，同时肌肉注射2支促排3号，间隔12 h后进行第2次人工授精，每次使用1支细管冻精。

1.3.3 胚胎回收及质量鉴定 第1次人工授精后7 d采用非手术法回收胚胎。根据卵巢反应情况，每侧子宫角反复冲洗6～8次。回收液经集卵杯过滤后，使用冲胚液反复冲洗侧壁滤膜3～5次，避免胚胎沾附在滤膜上，待回收液相对清亮后，放置到体视显微镜下确定胚胎质量。胚胎质量鉴定标准参考国家标准《牛胚胎》（GB/T 25881-2010）。

1.3.4 测定指标 不同试验组间供体牛黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数、回收效率（回收胚胎数/黄体总数）、胚胎可用率（可用胚胎数/回收胚胎数）、退化率（退化胚数/回收胚胎数）以及未受精率（未受精卵数/回收胚胎数）等指标。

1.4 统计分析 数据用SAS 9.2软件单因子方差分析进行差异显著性分析，多重比较采用Duncan´s法，并对超排前卵泡数进行正态分布检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 供体牛超排前有腔卵泡数正态分布检验结果 通过B超检查供体牛超排前3～5 mm的有腔卵泡数为6～28个，平均为15个，经SAS正态分布检验，供体牛超排前有腔卵泡数符合正态分布（图1）。

图1 供体牛超排前有腔卵泡数正态分布直方图

2.2 不同有腔卵泡数供体牛体内胚胎回收结果 由表2可知，Ⅲ组供体牛黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数显著高于其他2组（P＜0.05），Ⅱ组供体牛黄体数、回收胚胎数、可用胚胎数显著高于I组（P＜0.05）；Ⅲ组供体牛的退化胚数、退化率显著高于其他2组（P＜0.05）。3个组间的回收效率和未受精率无显著差异（P＞0.05）；Ⅲ组供体牛的胚胎可用率显著低于I组（P＜0.05）。

3 讨 论

初情期后或产后未妊娠母牛卵巢上卵泡和黄体呈现周期性变化，受下丘脑-垂体-卵巢生殖轴的反馈调节。每个卵泡发育波开始出现前，下丘脑分泌促性腺激素释放激素增加，促进垂体 FSH 合成和分泌，FSH促进卵巢上小的有腔卵泡发育，卵泡在发育过程中不断分泌雌激素，反作用于生殖调控轴抑制FSH的分泌，在较低FSH浓度下直径达到8 mm的有腔卵泡仍然可以继续发育成为优势卵泡，如果此时无黄体存在，优势卵泡将继续发育成熟，破裂排卵，而其他体积较小的有腔卵泡在较低FSH浓度下不能继续生长，如果此时给予外源FSH持续性刺激，小的有腔卵泡也可以生长发育，出现多卵成熟并排卵的现象。然而，有腔卵泡的发育潜力取决于不同个体原始卵泡的多少。研究表明，不同青年母牛原始卵泡总数在60 000～240 000，表现在后期每个卵泡发育波中有腔卵泡的差异高达6～7倍[7]，即供体牛不同原始卵泡水平影响后期的卵泡发育潜力，进而影响超排效果。本实验首次在国内采用更直观的方式监测不同供体牛的卵巢活性，即通过B超检测卵巢有腔卵泡数，研究有腔卵泡数对供体牛超排效果的影响，结果表明，供体牛超排前有腔卵泡数在6～28个，平均为15个，呈正态分布，随着供体牛超排前有腔卵泡数增多，黄体数、回收胚胎数及可用胚胎数随之增多，与Center等[5]的研究结果一致，说明超排前有腔卵泡数可以作为供体牛的筛选标准之一。本研究结果也表明，随着回收胚胎数增多，胚胎可用率有降低趋势，退化率有增加趋势，这在毕江华等[8]的研究数据中也有类似现象，这可能是因为在外源FSH诱导下过多的有腔卵泡同时发育成熟并排卵，影响卵母细胞质量，虽然能够成功受精，但后期胚胎发育能力下降，进而导致退化率升高，但具体机理尚未见报道，有待下一步研究探索。

综上所述，有腔卵泡数可以作为供体牛的筛选标准之一。