外周血循环肿瘤细胞与肾癌病理指标及患者预后的关系

李昊 陈从波 姚启盛 龚小芳

[摘要] 目的 探究外周血循环肿瘤细胞（CTCs）与肾癌病理指标及患者预后的关系。 方法 将2014年2月～2017年12月湖北省十堰市太和医院收治的107例肾癌患者及查体的20例健康志愿者纳入研究，采用免疫磁珠富集及免疫荧光化学染色法进行外周血CTCs计数，分析CTCs阳性率与肾癌患者年龄、性别、临床分期、T分期、Fuhrman分级及中性粒细胞、血钙、血小板等临床指标的关系，并探究外周血CTCs与肾癌患者预后的关系。 结果 肾癌患者CTCs检出率为66.35%，健康志愿者外周血中未发现CTCs;CTCs阳性率与患者T分期、临床分期及中性粒细胞增多相关（P < 0.05），Logistic回归分析提示患者T分期为独立危险因素（OR = 1.816，95%CI：0.814～4.052，P < 0.05）;所有患者均进行随访，随访时间为60～627 d，CTCs阳性患者的中位生存时间短于CTCs阴性患者（P < 0.05）。 结论 外周血CTCs阳性检出率与肾癌患者T分期、临床分期及中性粒细胞增多相关，其中肿瘤T分期是外周血CTCs的独立危险因素，外周血CTCs可作为判断肾癌患者预后的辅助信息。

[关键词] 外周血循环肿瘤细胞;肾癌;病理指标;预后

[中图分类号] R737.11          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（b）-0085-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between peripheral blood circulating tumor cells （CTCs） and pathological paramets， and prognosis of renal cancer. Methods One hundred and seven patients with renal cell carcinoma admitted to Taihe Hospital of Shiyan in Hubei Province， from February 2014 to December 2017 and 20 healthy volunteers who performed physical examination were enrolled in the study. The immunomagnetic enrichment and immunofluorescence staining methods were used to count peripheral blood CTCs. The relationship between the positive rate of CTCs and age， gender， clinical stage， T stage， Fuhrman grade， clinical parameters such as neutrophils， serum calcium and platelets were analyzed. The relationship between peripheral blood CTCs and the prognosis of renal cancer was explored. Results The detection rate of CTCs in patients with renal cancer was 66.35%. No CTCs were found in peripheral blood of healthy volunteers. The positive rate of CTCs was related to the T stage， clinical stage and increase of neutrophils （P < 0.05）. Logistic regression analysis showed that T stage was an independent risk factor （OR = 1.816， 95%CI： 0.814-4.052， P < 0.05）. All the patients were followed up for 60-627 d. The median survival time of CTCs positive patients was shorter than that of CTCs negative patients （P < 0.05）. Conclusion The positive rate of CTCs in peripheral blood is related to T stage， clinical stage and increase of neutrophils in patients with renal cancer. The T stage of tumor is an independent risk factor for peripheral blood CTCs. Peripheral blood CTCs can be used as auxiliary information for judging the prognosis of patients with renal cancer.

[Key words] Peripheral blood circulating tumor cells; Renal cancer; Pathological index; Prognosis

腎癌是发病率仅次于膀胱癌的泌尿系统肿瘤，近年来有逐年上升的趋势[1]。外科治疗是肾癌主要治疗方式，但是约1/3患者在就诊时就已出现转移，且术后极易复发，晚期肾癌的预后效果不佳。因此临床上肾癌的早期诊断、控制及预防癌症转移、复发是目前肾癌治疗的重大课题之一[2-3]。循环肿瘤细胞（CTCs）是肿瘤原发或病灶播散于血液中的肿瘤细胞，可定植形成肿瘤转移病灶，研究显示CTCs数量与肿瘤的恶性程度、放化疗治疗反应等密切相关[4]。对外周血CTCs进行分析研究，可明确癌症转移过程，对辅助诊断、治疗效果监测及预后判断等方面均具有重要应用价值[5-6]。目前，乳腺癌、前列腺癌及结肠癌CTCs检测均被批准用于临床，而肾癌CTCs的临床应用尚待推进[7]。本研究对肾癌患者及健康志愿者外周血CTCs水平进行测定，联系肾癌患者各临床病理指标进行分析，探究外周血CTCs与肾癌预后的关系。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2014年2月～2017年12月湖北省十堰市太和医院（以下简称“我院”）收治的107例肾癌患者纳入研究。纳入标准：经病理科确诊为肾癌;患者相关检查及病理资料完整;患者及家属对本研究知情同意。排除标准：合并严重感染、重要脏器病变患者;已接受手术或放化疗等治疗的患者。纳入107例患者作为肾癌组，其中男63例，女44例;年龄34～71岁，平均（55.96±8.49）岁。TMN分期及临床分级采用美国癌症联合委员会肾癌分期标准[8]，T分期：1期32例，2期30例，3期24例，4期21例;临床病理分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期29例，Ⅲ期22例，Ⅳ期20例;病理分级采用Fuhrman分级标准[9]，病理分级：1级15例，2级44例，3级38例，4级10例。另择同期于我院体检中心进行体检的20名健康志愿者作为对照组，其中男12名，女8名;年龄34～72岁，平均（54.88±7.67）岁。肾癌组及对照组性别组成及年龄比较差异无统计学意义（P < 0.05），具有可比性。所有患者及家属均签署同意书，本研究通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 CTCs检测方法  采用免疫磁珠富集及免疫荧光化学染色法，具体操作：①细胞富集与固定：采集患者肘正中静脉血，置于ACD抗凝管中，采集的血液样本在48 h内完成CD45磁珠富集，富集所得的细胞沉淀物，加入40 μL AS1液重悬细胞，小心吹打，将混匀的细胞液加至包被的Cytospin玻片中央加样区，静置1～2 h，待玻片干燥后置于-80℃备用;②细胞化学染色：在暗室中，向玻片上加入抗CD45、CK18、CK19、CK8抗体及0.2%BSA荧光抗体，静置90 min后用BSA及TBS清洗3次，于细胞区加入7 μL荧光计数液，加盖玻片封片，于显微镜下计数。

1.2.2 CTCs鉴定  细胞呈圆形、椭圆形或长形;细胞形态及边缘完整，可见完整细胞核结构。免疫荧光染色可见CK18+、CD45-、DAPI+、CK染色与细胞核有50%以上面积重合。光镜下可见PanCK染色呈蓝黑色或褐色。由两位经培训的实验员分别按照上述标准进行阳性细胞的判定及计数，有意见不一致的情况由2人协商或在第3人协助下判定。

1.2.3 数据收集  收集患者临床分期、T分期、Fuhrman分级及中性粒细胞、血钙、血小板等血清学指标。其中临床分期由2名临床医生独立进行评定并进行核对，不一致者再次评定;T分期、Fuhrman分级等根据病理医师出具的术后病理诊断报告记录;血清学指标根据血清检验报告记录，白细胞计数>9×109/L视为白细胞增多;血小板计数>600×109/L视为血小板增多。

1.3 随访

对所有肾癌患者进行随访，记录6、12个月累计生存情况，累计生存率=生存例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0对所得数据进行统计分析，计数资料以频数及率表示，组间比较采用χ2检验;计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CTCs检出情况比较

肾癌组中71例患者外周血检出CTCs，检出率为66.35%;检出个数为0～18个，平均（3.02±0.26）个/mL。对照组外周血中未检出CTCs。

2.2 外周血CTCs與病理指标相关性分析

比较外周血CTCs检出阳性率与各临床指标之间的关系，T分期为3～4期患者的CTCs阳性检出率显著高于1～2期患者（P < 0.05）;临床病理分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者CTCs阳性检出率显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05）;中性粒细胞数增多患者阳性率显著高于未增多患者（P < 0.05）。见表1。

对上述差异有统计学意义的指标，采用Logistic回归分析进行进一步分析，结果提示T分期为CTCs阳性的独立危险因素（P < 0.05）。见表2。

2.4 外周血CTCs与肾癌患者预后的关系

对肾癌组患者随访，随访时间为60～627 d。根据CTCs检查结果将肾癌组分为CTCs阳性组与CTCs阴性组，对两组预后进行比较，结果显示CTCs阳性组生存时间短于CTCs阴性组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

肿瘤的转移与患者预后关系密切，其具体过程以肿瘤细胞脱离原发灶，转移、定植到血液、骨髓、淋巴结及远处器官为主，以往研究认为恶性肿瘤的转移是癌症进展到晚期的事件，近年来研究发现肿瘤的侵袭及转移在癌症早期就已发生，CTCs散播进入外周血可能是恶性肿瘤发生转移的标志及起源，其在肿瘤转移中扮演重要作用[10-11]。CTCs对多种肿瘤的预后价值已得到诸多研究证实，明星等[12]探究CTCs在食管鳞癌中的预后价值，研究发现首诊CTCs阴性患者的中位生存时间显著高于首诊CTCs阳性患者。Giuliano等[13]对492例晚期乳腺癌患者进行CTCs检测，发现术前CTCs≥5个/7.5 mL的患者较CTCs<5个/7.5 mL的患者转移部位多，且极易发生新的转移病灶。Tol等[14]研究发现外周血CTCs>3个/7.5 mL的晚期结直肠癌患者总生存期及无进展生存期显著短于CTCs≤3个/7.5 mL的患者。CTCs与肿瘤进展及预后关系密切，但其与肾癌的关系仍研究较少，本研究对肾癌患者及健康志愿者外周血CTCs水平进行检测，旨在探究外周血CTCs与肾癌临床指标及预后的关系。CTCs在外周血中含量较少，大大增加CTCs的检测难度[15]，本研究采用免疫磁珠富集及免疫荧光鉴定的方法，利用CTC的生物学特性，去除外周血非上皮来源细胞干扰，提高CTCs富集质量。本研究中肾癌患者CTCs阳性检出率为66.35%，而20名健康志愿者外周血中未检测到CTCs，提示检测效果较为可靠。

本研究对不同病理资料的患者CTCs阳性检出率进行分析，发现不同分期、临床分级患者的CTCs检出率差异显著，具体表现为高T分期、临床病理分期患者CTCs检出率显著高于低T分期、病理分期患者。病理分期是根据肿瘤体积、浸润程度等情况描述肿瘤进展情况，是癌症的主要预后因素之一，较高的T分期预示着较为广泛的肿瘤侵犯范围，相较于低T分期患者来说，肿瘤细胞更易释放于血液中[16-17]。结合本研究结果推测CTCs细胞数量与肾癌肿瘤体积及浸润范围相关，较高的病理分期具有更大的病灶，极易向血液中播散并形成转移，这也是高分期患者生存预后较差的原因。临床分期反映肿瘤转移范围，本研究结果显示临床分期与CTCs阳性检出率相关，提示肾癌CTCs可作为早期诊断肾癌进展、转移的指标之一。另外本研究亦发现CTCs与中性粒细胞数计数增高相关，肿瘤的发生和发展与体内炎症状态及免疫状态间的平衡息息相关，持续的炎性反应可促使肿瘤细胞逃脱宿主免疫反应从而促进肿瘤远处转移，中性粒细胞是肿瘤细胞免疫逃逸过程的重要参与者，亦是晚期癌症预后的预测因素之一[18-19]。为进一步探究CTCs与肾癌预后的关系，对CTCs阳性与阴性患者的生存期进行分析，结果显示CTCs阴性患者中位生存时间长于CTCs阳性患者，Bluemke等[20]在154例肾癌患者随访中发现，CK阳性的CTCs检出率与患者预后情况呈正相关，CK与CTCs阳性是肾癌预后的独立危险因素;结合本研究中CTCs与肾癌分期的研究，CTCs的检出情况可一定程度反映肿瘤生物学特性及浸润情况，可作为判断患者预后的辅助信息。

综上，外周血CTCs阳性检出率与肾癌患者T分期、临床病理分期及中性粒细胞增加相关，其中患者T分期是外周血CTCs的独立危险因素，外周血CTCs可作为判断患者预后的辅助信息。

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（收稿日期：2018-05-21  本文編辑：金   虹）