ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞的抑制作用

林庆焕 丁茸 毕婷婷 林健 邓贵华

[摘要] 目的 研究ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞EC109/CDDP的作用。 方法 采用MTT法检测ABT-263对耐药细胞EC109/CDDDP及其亲代细胞EC109的细胞毒作用;通过克隆存活实验检测ABT-263对食管癌细胞再生能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的情况，并通过Western blot检测细胞PARP蛋白的变化。 结果 MTT实验結果显示ABT-263对EC109及EC109/CDDP的细胞活力均有显著抑制作用;克隆存活实验结果显示ABT-263可以抑制食管癌细胞的再生能力（P < 0.01）;流式凋亡结果分析显示ABT-263诱导食管癌细胞发生细胞凋亡（P < 0.01）;Western blot结果显示ABT-263显著上调细胞PARP蛋白的剪切（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 ABT-263抑制食管癌EC109/CDDP细胞及其亲代细胞EC109的细胞活力和增殖能力，诱导细胞发生凋亡。

[关键词] ABT-263;食管癌;顺铂耐药;凋亡

[中图分类号] R730.23          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（b）-0012-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of ABT-263 on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line of EC109/CDDP. Methods The cytotoxicity of ABT-263 in the cisplatin-resistant cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109 was measured by MTT assay. Colony formation assay was used to determine the effect of ABT-263 on cell renewable capacity of esophageal cancer cells. Flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis. Western blot was used to investigate the changes of protein expression of PARP. Results MTT assay results showed that ABT-263 significantly inhibited the cell viability of EC109 and EC109/CDDP. Colony formation assay indicated that ABT-263 inhibited the cell renewable capacity of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Flow cytometry analysis revealed that ABT-263 induced apoptosis of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Western blot results showed that ABT-263 significantly increased the protein expression of cleavage PARP （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion ABT-263 exhibits cytostatic and cytotoxic effects on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109， while it induces apoptosis.

[Key words] ABT-263; Esophageal cancer; Cisplatin-resistant; Apoptosis

食管癌作为最常见的八大癌症，在全世界范围内增长迅猛，患者死亡率高，而我国也是世界上食管癌最为高发的地区之一[1-3]。顺铂作为在肿瘤治疗中应用最广泛有效的化疗药物之一，对包括食管癌在内的多种实体瘤和血液恶性肿瘤具有很好的治疗效果[4]。但是，随着肿瘤细胞对顺铂产生耐药性，对耐药细胞的治疗已经成为新的挑战[5]。ABT-263作为一种新型Bcl-2家族蛋白抑制剂，不仅能通过抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白促进肿瘤细胞发生凋亡，而且对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞也有抑制作用[6-8]。本研究主要以ABT-263处理顺铂耐药食管癌细胞EC109/CDDP及其亲代细胞EC109，检测药物能否有效抑制细胞的增殖和再生及其对细胞凋亡的影响，探讨ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞的体外抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人源食管鳞癌细胞株EC109来源于中国医学科学院肿瘤研究所（北京），顺铂耐药细胞株EC109/CDDP来源于南方医科大学药学院[9]。ABT-263购于美国Sellsck公司;RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素/链霉素）、胰蛋白酶、蛋白Marker购于美国Gibico公司;MTT、二甲基亚砜（DMSO）、苏木精染料购于美国Sigma公司;PBS粉末购于广州展晨生物技术有限公司;RIPA蛋白裂解液、RIPA Lysis Buffer、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白酶抑制剂混合物Protease Inhibitor Cocktail购于北京康为世纪生物科技有限公司;蛋白上样缓冲液、LDS Sample buffer购于美国Invitrogen公司;PVDF膜购于瑞士罗氏公司;ECL化学发光试剂盒、PARP抗体、β-actin抗体、二抗羊抗兔IgG购于美国CST公司;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。

1.2 细胞培养

使用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）于37℃、5%CO2环境下对食管癌细胞进行常规培养，对数生长期进行传代处理。

1.3 MTT法检测ABT-263对食管癌细胞活力的影响

取对数生长期的食管癌细胞EC109和EC109/CDDP用胰蛋白酶進行消化、离心并计数。根据计数结果，取适量细胞悬液，以3000个/孔接种于96孔板中静置过夜。分别加入0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的ABT-263处理细胞48 h后，换用含MTT（5 mg/mL）的培养基继续培养4 h，去除培养基并加入DMSO（150 μL/孔），振荡后用酶标仪在570 nm波长处检测OD值。计算各浓度组平均OD值，以0 μmol/L为对照，计算各孔OD值相对0 μmol/L浓度平均值的相对吸光率，以100%减去各孔相对吸光率计算抑制率并绘制抑制率曲线。

1.4 克隆存活实验检测ABT-263对食管癌细胞再生能力的影响

细胞接种于6孔板后，对照组和实验组分别加入1‰的DMSO（ABT-263 0 μmol/L）和10 μmol/L的ABT-263对细胞进行常规培养48 h。收集细胞，离心并计数后以3000个/孔接种于6孔板中，将细胞放置于培养箱中常规培养12～14 d，每2天更换一次培养基，直至克隆斑形成。去除培养基并用PBS溶液洗涤，接着用95%乙醇固定，最后用苏木精染料对细胞进行染色并对克隆斑进行计数。

1.5 Annexin V-FITC检测ABT-263对食管癌细胞凋亡的影响

细胞接种于6孔板后，对照组和实验组分别加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263处理细胞48 h。用不含EDTA的胰酶将细胞消化后收集于离心管中，1200 r/min离心5 min，用4℃预冷的PBS溶液清洗细胞;取3 mL的1×Binding buffer将细胞重悬并转移至流式管中，离心后轻轻弃去上清液，每管用100 μL的1×Binding buffer将细胞重悬并加入5 μL的Annexin V-FITC染料，室温下避光孵育15 min后再加入400 μL的1×Binding buffer并混匀，之后上机检测，通过FlowJo 7.6软件对结果进行分析处理。

1.6 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白PARP的变化

细胞接种后，对照组和实验组分别加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263处理细胞48 h。之后将培养皿置于冰上，加入60 μL/皿的预冷RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）充分裂解后提取蛋白于预冷的1.5 mL EP管内。BCA法测定蛋白浓度后，依比例将蛋白样品的浓度进行归一化后，100℃金属浴加热5 min。垂直电泳槽内加入20 μL/孔的蛋白样品，并对蛋白样品进行分离，转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h后，一抗4℃孵育过夜。取出PVDF膜在摇床上用1×TBST漂洗液清洗3次，每次10 min。之后对条带二抗室温孵育1 h，用1×TBST洗膜6次，每次5 min，加ECL发光液显影。

1.7 统计学方法

应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析和图表制作，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABT-263对EC109和EC109/CDDP细胞活力的影响

ABT-263处理能够明显抑制食管癌细胞EC109和EC109/CDDP的细胞活力，且抑制作用具有浓度依赖性。其对EC109和EC109/CDDP细胞的IC50值分别为（10.47±0.30）μmol/L和（8.72±0.62）μmol/L。

2.2 ABT-263对EC109和EC109/CDDP细胞再生能力的影响

经过ABT-263处理的食管癌细胞EC109和EC109/CDDP再生能力均受到明显抑制。以对照组（ABT-263 0 μmol/L）克隆斑数目为100%，ABT-263处理后EC109和EC109/CDDP细胞的克隆斑数目分别为（68.53±3.73）%和（54.64±2.22）%。与对照组比较，EC109和EC109/CDDP细胞克隆斑数目均减少，差异有高度统计学意义（t = 7.95、23.92，均P < 0.01）。

2.3 ABT-263对EC109和EC109/CDDP细胞凋亡的影响

ABT-263处理食管癌细胞48 h后，实验组（ABT-263 10 μmol/L）细胞凋亡明显多于对照组（ABT-263 0 μmol/L）[EC109：（9.79±0.84）%比（3.77±0.16）%;EC109/CDDP：（22.34±1.19）%比（9.73±0.16）%]，差异有高度统计学意义（t = 9.93、14.88，均P < 0.01）。

2.4 ABT-263对EC109和EC109/CDDP细胞PARP蛋白表达的影响

与对照组（ABT-263 0 μmol/L）比较，实验组（ABT-263 10 μmol/L）EC109及EC109/CDDP细胞PARP蛋白的剪切明显上调（t = 9.71，P < 0.05;t = 16.87，P < 0.01）。

3 讨论

食管癌主要分为鳞状细胞癌和腺癌两大类。食管鳞癌在发展中国家中较为常见，其可能发生于整个食管部位，作为最致命且研究最少的癌症之一，其长期预后情况非常糟糕，总体5年生存率为15%～25%[10-11]。当前食管癌的治疗多采用多模式的治疗方式，其中化疗以及辅助性化疗依然是最重要的手段之一，而顺铂在食管癌化疗中占据着不可或缺的地位[11-13]。但是，化疗中肿瘤细胞对药物产生耐药性仍然是顺铂化疗所面临的最大挑战。

ABT-263能选择性抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w，进而诱导肿瘤细胞发生凋亡[7]。有文献报道ABT-263能够抑制食管癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡[14]，我们此前的研究也发现该药物能够诱导食管癌细胞发生G1/G0周期阻滞、凋亡和自噬[15]。为了进一步探讨ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞的作用，本研究采用ABT-263处理顺铂耐药细胞EC109/CDDP及其亲代细胞EC109并检测细胞活力、细胞再生能力以及细胞凋亡情况。实验结果显示ABT-263对食管癌亲代细胞和顺铂耐药细胞的细胞活力和再生能力均有显著抑制作用，且能够诱导细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。

顺铂主要通过与肿瘤细胞DNA结合并导致其损伤从而诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。然而，顺铂化疗的过程中常受到其获得性耐药的限制。顺铂获得性耐药的主要机制包括减少药物蓄积和增强药物灭活、促进DNA修复、抑制凋亡信号传导和间接调控因子的改变等[16]。已有研究表明，自噬作为肿瘤细胞的一种保护机制，抑制其作用能够提高顺铂对耐药食管癌细胞的抗肿瘤作用[17]。此外，C-末端结合蛋白-2和食管癌相关基因-2也能够通过影响肿瘤细胞凋亡通路从而调节耐药细胞对顺铂的敏感性[18-19]。而铜离子转运蛋白-1的表达下调介导了顺铂诱导的食管癌细胞EC109耐药[9]。本研究结果显示ABT-263处理耐药细胞EC109/CDDP能够抑制细胞活力和再生能力，这很可能是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而完成。尽管发生凋亡的机制尚不明确，但是PARP蛋白剪切的上调提示caspase通路对其产生作用[15，20]。同时我们还发现，相同浓度的ABT-263处理食管癌细胞，耐药细胞受到的抑制作用比亲代细胞更强，显示其对顺铂耐药细胞的抑制优势。以上结果提示ABT-263或许能够给顺铂耐药食管癌的治疗提供新的选择和思路，其体内抗癌活性及具体机制仍待进一步的研究探讨。

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（收稿日期：2018-07-29  本文編辑：罗乔荔）