PCR-RFLP法检测DDAH2基因rs805304多态性的实验条件研究

石柔 董荣静 刘华 李会芳

[摘要] 目的 探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（DDAH2）rs805304多态性的最适实验条件。 方法 运用PCR-RFLP技术分别对2016年1月～2017年3月昆明医科大学第一附属医院收治的182例2型糖尿病患者和147名健康体检者DDAH2基因rs805304的多态性进行检测，对影响PCR-RFLP方法的主要因素进行研究。 结果 最适实验条件：退火温度为58℃，变性温度为95℃，2× Power Taq PCR Master Mix浓度为12.5 μL，引物浓度为0.8 μmo/L，酶切体系为15 μL体系中加8.0 μL产物，用5 U的限制性内切酶BstUI消化。 结论 最适实验条件的摸索为后续研究奠定了基础。

[关键词] 聚合酶链反应;限制性片段长度多态性;二甲基精氨酸二甲胺水解酶2;实验条件

[中图分类号] Q346.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the optimum experimental conditions for dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2 （DDAH2） gene rs805304 polymorphism by polymerase chain reaction - restricted fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Methods The DDAH2-rs805304 locus polymorphism in 182 T2DM cases admitted to the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2016 to March 2017 and 147 healthy controls were detected by PCR-RFLP. The main factors influencing PCR-RFLP were studied. Results The optimum conditions： annealing temperature was 58℃， denaturation temperature was 95℃， 2× Power Taq PCR Master Mix concentration was 12.5 μL， primer concentration was 0.8 μmo/L， the effective system was 15 μL including 8 μL DNA solution and 5 U restriction enzyme BstUI. Conclusion The exploration of optimal experimental conditions has laid a foundation for the subsequent research.

[Key words] Polymerase chain reaction; Restricted fragment length polymorphism; Dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2; Experimental condition

糖尿病發病率急剧增加，2017年全世界大约有4.25亿人患有糖尿病[1]，其危害主要来源于其血管并发症。非对称性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）被认为是内源性一氧化氮合成酶（NOS）抑制剂，人体绝大多数ADMA被二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylamine hydrolase，DDAH）代谢灭活。因此，通过抑制DDAH酶活性，可影响ADMA浓度，从而抑制NOS活性，减少一氧化氮的生成，促使血管内皮功能受损，介导糖尿病动脉粥样硬化的发生发展[2]。国内外学者发现DDAH/ADMA/NOS通路下调与胰岛素抵抗相关[3-4]，该途径还参与糖尿病中内皮细胞的衰老[5-6]。遗传因素可能影响体内DDAH活性，从而导致体内ADMA含量的改变[7-10]。近期研究提示DDAH2过度表达及其基因多态性可能与高血压、胰岛素抵抗相关[11-15]。然而DDAH2基因是否参与糖尿病血管并发症的发生，目前尚不清楚。本研究对聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测该基因位点多态性的最适实验条件进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 实验对象

1.1.1 2型糖尿病患者  选取2016年1月～2017年3月于昆明医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）糖尿病科住院部的云南地区汉族患者，根据1999年WHO诊断标准确诊的无亲缘关系同时排除合并急性代谢紊乱、感染、严重肝肾功能不全、妊娠及其他内分泌系统疾病的2型糖尿病患者182例，男93例，女89例，平均年龄（55.03±11.45）岁。

1.1.2 正常对照  选取同时期在我院进行健康体检的无亲缘关系的云南地区汉族人群，无糖尿病、高血压家族史，且糖耐量及其他检查结果均正常者为健康对照者，共147名，男75名，女72名，平均年龄（52.15±11.82）岁。

1.2 主要试剂

全血基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物有限公司，B518223），2× Power Taq PCR Master Mix（百泰克公司，pr1701），由上海生工生物有限公司根据人DDAH2基因组DNA序列，应用Primer软件设计并合成PCR用的引物：上游5′-AGAGGGGATGAGGGAA-AGAA-3′，下游5′-CCTTGTGTAGGCGAGCTCAT-3′，限制性内切酶BstUI（New England Biolabs公司，R0518V）。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取  从研究人群的外周血白细胞中用全血基因DNA提取试剂盒抽提DNA作为模板。

1.3.2 PCR实验条件  通过分别设定系列变性温度梯度、退火温度梯度、引物浓度梯度、2× Power Taq PCR Master Mix浓度梯度，最终确立最适PCR体系为：DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL（初浓度为10 μmo/L），2× Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，加入双蒸水至25 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min，之后按95℃ 45 s、58℃ 60 s、72℃ 60 s共35个循环，最后72℃延伸至5 min。

1.3.3 RFLP  取PCR产物8 μL、20×Buffer 1.5 μL、限制性内切酶BstUI 5 U（0.5 μL），加双蒸水至15 μL，放入水浴箱中于37℃过夜酶切（约16 h）。

1.3.4 DNA测序  随机选取不同基因型的PCR产物送大连宝生物公司进行测序，进一步证实酶切结果。

2 结果

2.1 最适扩增条件

2.1.1 变性温度  设定变性温度梯度为92～96℃，可见95℃和96℃时较92～94℃时的产物量明显增加，为保证Taq酶的活性，选95℃为最适变性温度。

2.1.2 退火温度  设定退火温度梯度为52～62℃，结果显示：58～62℃时较52～56℃时产物量多，58℃时产物量适中，并且未见明显非特异性产物，故选58℃为最适退火温度。

2.1.3 引物浓度  在终浓度0.2～1.0 μmo/L之间设定引物浓度梯度，电泳结果可见：引物浓度从0.2～0.8 μmo/L产物浓度逐渐增加，1.0 μmo/L产物浓度减少，选择引物二聚体少而产物量最高的0.8 μmo/L为最适引物浓度。

2.1.4 2× Power Taq PCR Master Mix浓度  在11.5～15.5 μL之间设定浓度梯度，结果显示：不同浓度下产生的条带清晰程度无明显变化，为了节约试剂，故选择12.5 μL为最适浓度。

2.2 RFLP体系及反应条件

酶切产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后显示结果清晰：无酶切位点纯合子AA基因型有2条条带（475、42 bp），有酶切位点CC基因型有3条条带（388、87、42 bp），杂合子AC基因型有4条条带（475、388、87、42 bp），由于小于100 bp的片段电泳后游离到胶外，故87、42 bp片段不易看见。故确定上述条件为最适酶切条件。

2.3 基因型测序分析

随机抽取不同基因型的PCR产物各10例进行测序，结果显示凝胶电泳结果与测序结果一致。

3 讨论

对于已知点突变的研究，经典的PCR-RFLP技术是最常用的方法之一，它具有产率高、快速、简便、特异、敏感、重复性好等优点[16]。本研究即选用该方法对DDAH2基因rs805304多态性进行分析。影响PCR的因素很多，如果没有找到最佳实验条件，可能会导致产物量少、非特异性扩增产物、引物二聚体形成等，甚至出现假阳性或假阴性。现将影响PCR-RFLP法检测DDAH2基因rs805304多态性的主要实验因素讨论如下：

变性温度：导致PCR失败的主要原因之一是变性温度过低，其可能导致解链不完全。但温度也不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响[17]。一般情况下，93～96℃足以使模板DNA变性。我们在92～96℃之间设系列变性温度，随着温度的提升，产物量明显增加，同时为保证Taq酶的活性，故选95℃为最适变性温度。

退火温度：引物的复性温度就是退火温度，它的高低主要由引物的CG含量、长度决定。通常引物的解鏈温度是可以运用公式计算得到的，而复性温度应低于解链温度的5℃。通常，随着退火温度的降低，扩增产量逐渐增加，但错配现象可能增多;随着复性温度的升高，扩增的特异性逐渐提高，但扩增产量下降[18]。笔者在实验中发现58℃时产物量适中，并且未见明显非特异性产物，故选58℃为最适退火温度。

引物浓度：引物浓度不宜过高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗糙时，容易产生非特异性产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也好[19]。根据说明书，笔者把引物终浓度范围设定在0.2～1.0 μmo/L，结果均有产物扩出，引物浓度在0.8 μmo/L时，非特异性产物较少而产物量最高，为保证酶切效果，确定该浓度为最适引物浓度。

2× Power Taq PCR Master Mix浓度：该预混制剂包含Taq DNA聚合酶、优化的Taq缓冲区、MgCl2和核苷酸。本制剂节省时间，减少污染，相比传统的Taq DNA聚合酶，它确保更高的灵敏度和收益率。浓度过高会出现非特异扩增，过低时PCR产物量低。本研究通过设定11.5～15.5 μL范围内的系列浓度，得出12.5 μL为最适浓度。

酶切条件：限制性核酸内切酶价格昂贵，酶切体系中加入过多的酶量，造成不必要的浪费，而酶量过少会导致电泳结果不清晰[20]。本研究按照说明书推荐的体系，显示酶切完全，结果清晰，后减少酶切时间及BstUI用量均导致酶切效果不佳，故确定扩增产物8 μL、限制性内切酶BstUI 5 U（0.5 μL），过夜酶切16 h为最适酶切条件。

本研究确立了PCR-RFLP法检测DDAH2基因rs805304多态性的最适实验条件，为后续开展DDAH2基因rs805304多态性与2型糖尿病肾病的相关性研究提供了快速、特异、可靠的方法。

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（收稿日期：2018-10-08  本文编辑：张瑜杰）