隐球菌感染诊断的研究进展*

赖 锐，邱玉芳，刘惟优

(赣南医学院 1.2016级硕士研究生;2.第一附属医院呼吸内科，江西 赣州 341000)

隐球菌是一种无菌丝的单细胞芽生的酵母型真菌，广泛存在于空气、土壤、树木和鸽粪中[1-2]。致病菌主要包括新型隐球菌和格特隐球菌，其分子分型目前主要分5型：血清型A、D、 AD、B和血清型C，前三型多见于新型隐球菌，后两型多见于格特隐球菌[3]。全球每年约有100万人感染隐球菌，并且造成约63万人死亡[4-7]。新型隐球菌多见于撒哈拉以南非洲，主要感染免疫功能低下，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和器官移植者[8]，而格特隐球菌多见于热带和亚热带地区，但曾在温哥华岛爆发流行，常感染免疫功能正常的宿主[8]。有研究报道：在中国，最常见的真菌病原体是假丝酵母属，其次是隐球菌属(7.7%)。近年以来，我国隐球菌属的感染逐渐增加，无论是大陆还是台湾都以新生隐球菌菌株的血清型A、基因型VNI和交配型α占主导地位，且多见于免疫功能正常者，但HIV感染仍然是我国隐球菌病最常见的危险因素[2,9]。

近年来，广谱抗生素、HIV感染、肿瘤放疗和化疗、器官移植、皮质激素和免疫抑制剂等的增加也使隐球菌感染的发病率增加[10-11]，且患病率和致死率也在全球范围内升高，有研究发现，无高危因素的隐球菌病比存在高危因素的隐球菌病的诊断需多2倍时间，导致死亡率升高究其原因是对隐球菌感染的的认识不够，未能早诊断、早发现、早治疗[12-13]。本文主要根据近几年隐球菌感染的诊断方法从血液学、病原学、影像学、免疫学和病理学以及分子生物学等方面进行阐述。

1 血液学检查

一般血液学检测无特异性，很难与病毒、细菌感染鉴别。血白细胞计数可正常或轻中度升高，多数在10 ×109·L-1～ 20×109·L-1之间, 中性粒细胞可轻度升高，病情进展中后期可出现血红蛋白及红细胞数减少。感染指标：C反应蛋白(CPR)或降钙素原(PCT)都可轻度升高，也可出现血沉加快。隐球菌患者血清1，3-β-D葡聚糖(G试验)常为阴性，这是由于隐球菌细胞壁中1，3-β-D葡聚糖含量少且外层包裹很厚的荚膜多糖所导致的。而血半乳糖甘露聚糖试验(GM试验)阳性率也很低，只有在隐球菌抗原滴度很高时，才易检出[14]。

2 病原学涂片和培养

检测方法简单，常用于疾病筛查，标本相对容易收集。标本主要包括痰、肺泡灌洗液、胸水、血液、脑脊液和尿液等。

2.1痰涂片和培养可见真菌孢子或隐球菌孢子包囊提示阳性，该检查法标本易收集，费用便宜，有助于筛查，但两者阳性率都较低，分别为25%和55%～80%，且缺乏特异性[15-16]。由于两者的阳性率与收集标本途径密切相关，所以条件允许下，可进行有创检查(如经纤维支气管镜保护性毛刷、肺泡灌洗或经支气管壁透壁肺活检、彩超引导下胸腔穿刺采取胸腔积液等)。若培养和(或)镜检发现隐球菌可确诊，但单次培养阳性并不能区分污染、定植和感染，所以对怀疑隐球菌肺感染者，应反复多次多途径培养，只有多次培养阳性才有参考价值。此外，若AIDS患者痰培养新生隐球菌阳性，应提高警惕，其可能存在播散性感染。

2.2脑脊液(CSF) 墨汁染色涂片是诊断隐球菌性脑膜炎最简单、快速的检测方法，其灵敏度与是否感染HIV也密切相关，未感染和感染HIV的隐球菌脑膜炎灵敏度分别为30%～50%和80%[17]，对脑脊液进行离心后镜检可以增加灵敏度，但淋巴细胞、髓小球、脂肪小滴、组织细胞以及其他酵母形式易导致假阳性，且该检测方法不能判断临床治疗疗效。有人提出，吖啶橙染色灵敏度为96%，可以替代墨汁染色[18]。樊新红等研究显示[19]，脑脊液阿立新兰染色对隐球菌的检出率可达95.8%，其可以使隐球菌荚膜内的酸性黏多糖着色，而对其他炎症细胞不着色，且其检测方法也简便。CSF培养阳性可见乳白色奶油菌落生长，长时间孵育后可能变成橙黄色或棕色菌落，这可确诊中枢神经系统隐球菌感染。HIV感染者培养阳性率高于非感染者，可达90%，而隐球菌脑炎或脑膜炎患者的血培养阳性率仅70%[20]。

3 影像学

为隐球菌感染的辅助诊断方法，影像表现变化多样，且缺乏特异性，但其可作为筛查手段，也可作为病情转归的评估方法。此外，MRI可辨别隐球菌细胞壁结构，可与肿瘤相鉴别。

3.1肺隐球菌病的肺部CT 表现可分为以下三种类型[21-23]：①结节或肿块型：以单发或多发结节型多见，约占 40%～60%，常见于单侧下肺外带靠近胸膜处，呈宽基底，结节大小不一，边缘可有分叶、毛刺、胸膜牵拉征，约40%结节周边可伴有晕征，是肺隐球菌病相对特异性的影像学表现，但仍需与转移瘤和原发性肺癌相鉴别。②浸润实变型：多见于免疫功能低下者，表现为大片或斑片状影，呈大叶性或节段性分布，少数患者可见支气管充气征，而聚集型分布、支气管充气征(多见于免疫功能正常者)是其相对特异性的CT影像可以与其他侵袭性真菌病鉴别。③混合型：常表现为多种形态和密度混合存在，多见于晚期播散性患者，易与肺结核相混淆。此外，约20%的患者伴有空洞性病变，多见于伴有HIV感染者，常呈局灶性、厚壁、偏心，内壁光滑的空洞，也可见薄壁和(或)中心空洞[24]；有少数患者，可见肿大的肺门淋巴结，未见钙化灶，肺间质磨玻璃影和肺野散在的微小结节，需与原发性和(或)粟粒性肺结核相鉴别或存在伴发肺结核[25]；还有部分患者可见胸腔积液, 常伴有胸膜下肺结节，免疫功能低下者多见。

3.2隐球菌脑炎或脑膜脑炎CT 表现多样，缺乏特异性，即可无异常，也可表现为双侧大脑半球和(或)基底节的脑实质不规则低密度和(或)高密度灶，脑膜强化，脑水肿及脑室扩大等[26]。MRI在小型、轻度病变的部位、范围、类型和评估严重程度及预后方面均优于CT检查[27-28]。MRI可表现为[29-30]：①平扫未发现异常，或出现脑沟、脑池线状强化；②软脑膜强化，最常见；③脉络膜炎和室管膜炎，可见多发斑片状或片状的长T1长T2信号(双侧基底节及额、颞、顶叶)，增强扫描后病变呈片状强化或无明显强化；④肉芽肿，常见于双侧大脑半球，可见单发或多发类圆形T1WI呈低信号、T2WI呈高信号、增强后呈结节状强化病灶，易误诊为肺癌脑转移；⑤脑积水，可见轻至中度对称性脑室扩张，多见于疾病中晚期。

4 隐球菌抗原检测

抗原检测是临床诊断隐球菌病常用方法，可用于多种标本检测，其灵敏性和特异性都较高，但不能区分基因型及隐球菌种类[31]。目前常用三种方法是：乳胶凝集试验法(latex agglutination test, LA)和胶体金试验法(lateral flow assay，LFA)以及酶联免疫吸附测定试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。

4.1血清乳胶凝集试验法(latex agglutination test，LA) 是以乳胶颗粒为载体，连接抗隐球菌荚膜多糖抗体，产生肉眼可见的凝集反应，当滴度≥1∶8时为阳性诊断。LA具有快速、简便、有效、并且优于镜检法和培养法的优点，但免疫功能正常者阳性率明显低于免疫缺陷者。有研究证实，LA灵敏度和特异度分别为93%～100%和93%～98%，其诊断价值高，同时可评估疗效和预后，但也存在假阳性和假阴性[32-34]。有文献报道，一些技术性问题(洗涤反应板被清洁剂及滑石粉污染标本)和一些感染问题(类风湿因子、巨球蛋白、毛孢子菌属、曲霉菌和抗酸杆菌等的抗原易被误检测为荚膜多糖抗原)可导致试验假阳性，但假阳性率较低，约为1%[16]。但有研究显示，标本经链霉蛋白酶和二硫苏糖醇处理后，可以消除类风湿因子等干扰因子的干扰。而钩带现象(钩带现象是指抗原与抗体浓度比例不合适而导致凝集反应不明显)和体内一些非特异性蛋白可掩盖隐球菌抗原反应，导致出现假阴性[35]。所以当只有单一的LA阳性结果时，不能草率的诊断隐球菌感染，需结合临床表现及其他实验室检查以诊断。但有人认为，免疫正常者LA阳性提示可能存在播散性感染[36]。

4.2胶体金试验法即CrAg横向流动测定法(lateral flow assay，LFA)，是一种夹心免疫层析试纸条试验。LFA具有标本处理简单，检测方法快速(<15分钟)，结果易读等特点，可用于隐球菌感染高危者及HIV患者的预防性抗真菌治疗前的筛查[37]。LFA与LA及酶联免疫吸附测定法等的灵敏度及特异度高度一致，其还可检测到一些其他血清学方法检测为阴性的格特隐球菌[34,38-39]。但LAF检测也存在假阴性和假阳性，比如疾病早期、血清抗原较少、溶血的血清样本、极高浓度的抗原(>0.140 mg·mL-1)等均可出现假阴性结果，如果在出现弱阳性或阴性，而又不除外前带现象(前带现象是指LFA检测极高浓度的隐球菌抗原时，出现弱阳性或阴性)时，可进行半定量滴度检测来排除假阴性[35]。隐球菌与曲霉菌存在交叉反应，可导致假阳性结果，将标本稀释后检测可降低假阳性率。此外，LAF的灵敏度和特异度与检测标本关系密切，血清和脑脊液标本灵敏度可达100%，特异度高达98%，但尿液标本灵敏度为70.7%～92%[40-41]。

4.3酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 以检测隐球菌抗原和抗体滴度进行诊断，也可评估病情转归，即抗体滴度升高提示病情好转。其灵敏度及特异度与前两种抗原检测相当，并也存在假阳性和假阴性[35,38-39]。既往隐球菌感染，隐球菌呼吸道定值均可导致假阳性。有研究显示，ELISA检测不同的标本阳性差异较大，尿液标本比血清或血浆阳性率低22倍。对于隐球菌孤立性病灶者，外周血或血清抗原检测常为阴性，但检测出高滴度阳性结果时，常意味着深部组织侵袭或存在播散可能。

5 病理学检查

病理学检查是诊断隐球菌病的金标准。典型的病理学特征为：可见小脓肿和凝固性坏死的非干酪性肉芽肿形成或形成趋势，或胶样病变。隐球菌菌体周围存在大于菌体1～3倍的荚膜，被常用各种染色方法检出[42]：墨汁染色、苏木精-伊红(HE)染色(因经验不足易导致漏诊)、过碘酸.雪夫(PSA)染色、六胺银染色(MGS)、奥尔辛蓝(AB)染色和黏液卡红(MC)染色等。有研究显示[43]，PSA、MGS和AB染色对隐球菌的阳性检出率分别为100%、97.4%和66.7%，但其他真菌感染时也显示阳性，则缺乏特异性[44]。而MC染色特异性最好，一般MC染色阳性，可确诊隐球菌病，但不能检测出干性隐球菌，易出现假阴性，而黑色素可使干性隐球菌着色，所以当MC染色阴性时，可加做黑色素染色以鉴别[45]。有研究显示，无论是新鲜标本还是甲醛固定的标本，电子显微镜对隐球菌荚膜的检出率较高，约85%，但其费用较高，一般应用于科研实验研究[34-35]。虽然病理检查是隐球菌病的金标准，但仍容易误诊或漏诊，这是与标本取材(样本较小，取材切面等)、真菌染色技术和病理医生对隐球菌的警惕性不够息息相关。

6 分子生物技术

近年来，分子生物技术在隐球菌分类、基因分型和诊断等研究中发展迅速，如染色体脉冲电泳、核酸探针技术、DNA指纹分类、聚合酶链反应(PCR)以及PCR结合其他技术等方法[46]。目前，PCR技术运用较多，因其具有简便、准确、灵敏的特点，但特异性较低，而PCR实时荧光定量技术可弥补这一不足，但其扩增效率的高低会直接影响结果的准确性[16]。DNA探针技术可以对菌株变种分型，并进行DNA指纹分类，可运用核酸定位追踪以进行流行病学调查，但其不能区分活菌与死菌。PCR指纹和多位点序列分型(MLST)可以鉴定隐球菌基因分型[9,47]，而且多位点微卫星分型(MLMT)可以进一步区分MLST鉴定为基因分型相同的菌株[48-49]。近来发现，下一代多位点序列分型(NGMLST)和分析软件程序(MLSTEZ)可实现高效、经济、高通量的多位点测序分型[50]，对流行病学调查研究和开发针对不同基因型进行特异性治疗以及隐球菌耐药与基因型是否相关等研究具有重要意义。

7 总结与展望

总之，目前诊断隐球菌感染首先通过一般实验室检查和影像学检查进行初步筛查，再以检测隐球菌抗原抗体的免疫学检查进行诊断，而病理诊断仍为目前诊断隐球菌感染的金标准。分子生物技术可对隐球菌进行基因分型等。但我们目前缺乏对隐球菌早期感染的特异性诊断方法，而且缺乏鉴定格特隐球菌感染的诊断技术，常导致临床格特隐球菌感染的漏诊。此外临床诊断不能区分隐球菌感染的种类、基因分型，不能在疾病早期明确诊断，从而不能早期进行针对性干预、降低死亡率。为此，我们应该增强对隐球菌感染的认识，特别是HIV阴性隐球菌感染和格特隐球菌感染，并且开发对各种/各型的隐球菌早期或潜伏感染的特异性诊断方法，做到早发现、早诊断、早治疗，从而提高治愈率，降低死亡率。