Sanger测序法在乙型肝炎患者耐药突变检测中的应用∗

2019-03-18张婧莹曹永彤

国际检验医学杂志 2019年1期

马亮，于洋，张婧莹，丛笑，刘倩，杨辉，曹永彤

(中日友好医院检验科，北京 100029)

乙型肝炎病毒(HBV)是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。慢性乙型肝炎病毒(CHB)在我国是一种传播范围广、感染人数众多的传染性疾病，我国HBV慢性感染者约为9 000万，居世界之首，每年约100万人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原发性肝癌[1-2]，CHB的监控和治疗一直以来都是传染病防治的重中之重。目前核苷酸类似物治疗CHB患者的疗效已得到肯定，但因其对HBV cccDNA无直接作用，患者需长期服用，在治疗过程中很容易引起HBV耐药突变[2]。长期使用单种核苷酸类药物，患者很容易发生针对此药物的耐药突变。同时，由于单种核苷酸药物耐药突变位点所对应药物的多重性，患者很可能产生新的耐药或交叉耐药，为临床治疗带来困难[3]。使用体外检测手段，对CHB患者进行基因耐药突变检测，可以准确有效地对其突变位点进行检测，以判断该患者对已知药物的耐受程度，进而更好地指导临床用药，制定个体化抗病毒治疗方案。目前，已有多种分子诊断技术平台可以检测乙型肝炎耐药基因突变[4]，Sanger测序法作为测序检测的“金标准”，是目前最为准确、有效的检测手段。本实验使用Sanger测序法对CHB患者血清核酸PCR产物进行测序，检测HBV耐药相关位点突变及HBV病毒基因型，统计目前常用药物对应位点发生突变的情况，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1病例标本收集2016年10月至2018年6月中日友好医院CHB患者血清共215例，其中男42例，女73例，年龄19～84岁，中位年龄39岁。所有患者均符合乙型肝炎诊断标准(WS299-2008)，HBV-DNA 大于1×103U/mL，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器 HBV-DNA提取试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；HBV-DNA测序试剂盒购自广州立菲达安诊断产品技术有限公司；C-1000 TOUCH PCR仪购自美国BioRad公司；3500Dx测序仪购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1标本采集采集患者空腹不抗凝静脉血5 mL,2 500 r/min离心10 min,分离血清。

1.3.2HBV-DNA提取使用生工生物工程(上海)股份有限公司DNA提取试剂盒，按照试剂说明书提取HBV-DNA。

1.3.3HBV-DNA扩增 50 ℃ 2 min，95 ℃共15 min预变性，94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，40个循环，72 ℃ 7 min。

1.3.4HBV-DNA纯化使用生工生物工程(上海)股份有限公司提取试剂盒，按照说明书所列步骤进行纯化。

1.3.5测序PCR 体系配置 PCR产物 0.5 μL，BigDye 2 μL，BigDye Buffer 3 μL，测序引物1 μL，无菌纯化水13.5 μL，总体积20 μL。扩增程度为96 ℃ 1 min，然后96 ℃ 10 s→50 ℃ 5 s→60 ℃ 4 min共25个循环，最后4 ℃保温。

1.3.6测序产物纯化各PCR反应管加入2 μL 125 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和2 μL 3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)，再加入50 μL 100%无水乙醇，短时振荡，室温避光放置15 min；4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，去上清，加入150 μL预冷70%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清，室温避光放置15～30 min；加入10 μL Hi-Di Formamide，短时振荡溶解DNA，短时离心，95 ℃变性5 min，冰中冷却4 min。

1.3.7电泳使用1%琼脂糖电泳，观察PCR产物存在及纯化情况。

1.3.8测序变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，选用具有IVD标志的Seq_std_BDTV3.1_ASSY_POP7 进行测序。

1.4数据收集与分析使用ABI公司Data Collection®与Sequencing Analysis软件进行数据收集和初步分析，使用STANDFORD软件对数据进行深度分析。

1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理。计数资料组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1在本研究215例患者中，共有40例(18.6%，40/215)患者检测到发生耐药基因突变，其中具有对应参考价值的为21例(9.77%，21/215)。该215例患者中相关药物耐药突变率从高至低依次是拉米夫定(LAM,9.77%,21/215)、恩曲他滨(FTC,7.44%,16/215)，恩替卡韦(ETV,6.98%,15/215)，替比夫定(LdT,6.05%,13/215)，阿德福韦(ADV,0.93%,2/215)；未检出与替诺福韦(TDF)耐药相关突变。常见CHB治疗用药与相关耐药突变位点，TDF为A194T；LdT为M204I；ADV为A181V/T、N236T；LAM/LMV为M204I/V、A181T/V、L180M、V173L；FTC为M204I、L180M、V173L；ETV为M204I、L180M。见表1。其余19例虽然检测到突变位点，但所发生突变的位点并不与耐药明确相关，以备注中与耐药明确相关的6个位点作为参考标准。

2.2耐药连锁位点突变情况在检测到的21例耐药突变患者中，发生耐药连锁位点突变的共11例，占52.38%(11/21)，其余为47.62%为单一位点突变。最主要的连锁模式为M204I+L180M，共7例；剩下两种连锁模式A181V+N236T和M204V+L180M各2例。

2.3不同基因型耐药基因发生情况本研究215例患者中B基因型占所有患者的29.77%(64/215),耐药发生比例为6.25%(4/64)；C基因型占所有患者的68.84%(148/215),耐药发生比例为11.49%(17/148)；D基因型占所有患者的1.40%(3/215)，耐药发生比例为0。本研究中C基因型明显高于B基因型(P<0.01),C基因型与B基因型基因突变情况差异无统计学意义(P>0.05)。

注：-表示无数据

3 讨论

乙型肝炎治疗的总体目标是最大限度地长期抑制或消除HBV,减轻肝细胞坏死及肝纤维化，延缓或阻止疾病进展，减少或防止肝硬化，肝癌及其并发症的发生。核苷类药物抗病毒治疗能很好控制疾病进展，长期治疗能使患者肝组织得到改善[5]。但是，长期应用核苷类药物会使HBV在药物选择压力和免疫压力下发生突变，产生耐药基因甚至临床耐药突变[6]。耐药的发生极大地降低了CHB患者的治疗效果。因此在治疗过程中动态地进行耐药监测对CHB的治疗和预后具有重要的意义。

而LAM目前仍是我国临床进行抗HBV治疗的主要药物，本研究中215例患者中21例患者发生LAM耐药突变，突变比例为9.77%(21/215)。在21例患者中，18例检测到M204I/V位点突变，其中9例伴随L180M位点突变；1例为V173L位点突变；2例为A181V突变。这类突变发生的比例较高，提示了LAM易产生耐药性。本研究结果与王清等[7]研究结果较一致。本研究中其他耐药突变检出率从高到低依次为FTC(16/215,7.44%)，ETV(15/215,6.98%)，LdT(13/215,6.05%)，ADV(2/215,0.93%)；未检出与TDF耐药相关突变。所以从本研究结果可以看出FTC、ETV和LdT 3种药物耐药发生率也比较高。患者发生TDF耐药突变在临床上确实很少出现，这也指示了TDF在乙型肝炎治疗广阔的应用前景。

HBV耐药突变位点连锁分析是指研究多个耐药突变位点是发生于同一个病毒株上还是位于不同病毒株上以及耐药位点的组合方式。多数情况下对同一药物的耐药是由多个耐药突变位点的存在所造成，并且多个耐药突变位点的组合情况对抗病毒药物是否产生耐药以及耐药的程度存在很大的不同[8]。LAM主要的耐药突变位点M204V/I较野生复制能力低，而L180M、V173L的出现使突变株HBV的复制能力接近野生株的水平[9]，因此，对HBV耐药突变位点进行连锁分析对于临床抗病毒治疗方案的选择以及流行病学的研究意义重大。本研究中主要的连锁模式也是M204I+L180M，与既往研究结果类似[10-11]。

HBV病毒可分为A～I 19种基因型，HBV基因型具有一定的地域性差异，我国南方以B型为主，北方以C型为主，D型主要见于西藏和部分少数民族地区。本研究中C基因型明显高于B基因型(P<0.01),支持HBV基因型具有地域性差异这一结论。并且本研究中也检测到少量D基因型1.40%(3/215)，这可能与北京人口流动较大有关。

关于HBV基因型与核苷类耐药的相关性分析，结论各有差异，有研究认为二者具有相关性[12]；另一项荟萃分析则表明二者之间没有显著相关性[13]。本研究中C基因型耐药基因发生频率高于B基因型，但差异无统计学意义。