保妇康栓对宫颈癌细胞SiHa体外增殖和凋亡的影响

2019-01-19李倩珺胡艺琳吴晓宾

国际检验医学杂志 2019年1期

李倩珺，胡艺琳，梁琰，王婷，吴晓宾，晁艳△

(1.广州医科大学附属第一医院，广东广州 510120；2.深圳市妇幼保健院，广东深圳 518028；3.广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510120。)

宫颈癌是女性生殖器官肿瘤中最常见的肿瘤之一，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是目前认为导致宫颈癌最主要的因素[1-2]。当今宫颈癌的治疗手段包括手术，放、化疗等，但这些措施均存在一定的弊端，如出现机体免疫功能下降，反生并发症，甚至死亡等[3]。近年来，中医药在抗病毒及抗肿瘤方面的作用日益引起关注，但其发挥作用的机制尚不明了[4-5]。纯中药栓剂保妇康栓由莪术油和冰片2味中药组成，可活血化瘀、清热解毒、去腐生肌，常用于治疗宫颈HPV感染。保妇康栓可改善局部免疫微环境并消除HPV感染，降低了高危型HPV感染患者向宫颈进展的危险性[6-7]。因此，本研究通过制备保妇康栓含药血清并作用于HPV16阳性人宫颈鳞癌细胞系SiHa细胞，观察细胞体外增殖及凋亡情况，旨在为临床应用中药预防并治疗HPV感染提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂细胞培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，二甲基亚砜购自上海华舜产品，青霉素和链霉素购自华北制药厂，胰酶及乙二胺四乙酸购自SERVA公司及赛多利斯公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所，核糖核酸酶和聚酰亚胺购自Sigma公司。

1.2药物保妇康栓主要成分为莪术油及冰片制成的溶液购自海南碧凯药业有限公司。重组人干扰素α-2b 水针剂购自安徽安科生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养选用细胞系为HPV16阳性人宫颈鳞癌细胞系SiHa，培养条件为于胎牛血清10%、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，DMEM培养基，5%CO2、温度37 ℃及饱和湿度。

1.3.2含药血清的提取选取雌性SD大鼠60只,平均体质量(200±30)g，随机分为中药组(保妇康栓组)、阳性对照组(干扰素组)和阴性对照组。每组每天灌胃给药1次，连续7 d，阳性对照组肌肉注射给药5 d。给药剂量为人临床给药等效剂量的10倍(200 g体质量大鼠给药剂量=60 kg体质量人给药剂量×0.018×100)。中药在末次给药后1 h，西药在肌肉注射后40 min，腹主动脉采血，血样于37 ℃水浴30 min，3 000 r/min离心10 min，吸取血清后灭活(56 ℃水浴30 min)并除菌(0.22 μm微孔滤膜过滤)，分装于1 mL无菌EP管备用。

1.3.3CCK-8比色法观察药物对SiHa细胞的生长抑制作用取数生长期细胞，胰酶消化离心后进行细胞计数(1 × 104个/mL)，接种于96孔培养板 (每孔100 μL)，37 ℃培养箱培养。细胞贴壁后加入8%含药血清培养基(设6个平等对照孔)，使终体积为200 μL，置培养箱培养24、48、72 h后加入20 μL CCK-8试剂，混匀，酶标仪测定每孔吸光度(OD值)。

1.3.4流式细胞仪检测细胞周期和凋亡每孔2 mL细胞悬液(2×105个/孔)加入6孔板中；置37 ℃培养箱24 h后加入8%含药血清培养基(100 μL/孔)，同时设阴性对照组；培养箱37 ℃培养72 h，消化并收集细胞。固定(-20 ℃无水乙醇)制备好的单细胞悬液，加入100 μL RNaseA，37 ℃ 30 min；再加入400 μL碘化丙啶PI染色30 min，采用流式细胞仪检测。每个样本获取10 000个细胞，采用ModFitLT 3.0软件分析结果。

2 结果

2.1CCK8检测细胞增殖中药物组和阳性对照组SiHa细胞增殖均有不同程度的抑制，阴性对照组细胞生长活跃，中药物组和阳性对照组与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且在24 h对其增殖的影响最为明显。见表1。

表1 各组宫颈癌SiHa细胞增殖比较值)

注:与阴性对照组比较，*P<0.05

2.2流式细胞仪检测细胞周期变化与阴性对照组比较，中药物组和阳性对照组SiHa细胞中G0/G1期细胞显著增多，S期细胞显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组SiHa细胞周期比较(%)

注:与阴性对照组比较，*P<0.05

2.3流式细胞仪检测凋亡变化中药物组和阳性对照组SiHa细胞凋亡率显著高于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组SiHa细胞凋亡率比较

注:与阴性对照组比较，*P<0.05

3 讨论

宫颈癌是女性发生比例较高的恶性肿瘤之一，其在发展中国家的发病率较高。宫颈癌发生过程通常为正常宫颈上皮发展为上皮内瘤变最后进展为宫颈癌，其中高危型HPV持续感染是促进瘤变发生的主要因素。

保妇康栓的主要成分为冰片和莪术。莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的干燥根茎，性温味辛苦，具有较好的抗肿瘤、抗炎、抗病原体、抗早孕、抗纤维组织增生和保肝等多种作用。其活性成分为挥发油，包括β-榄香烯、莪术酮、莪术醇和吉玛酮等，能直接抑制、破坏肿瘤细胞和灭活病原体，还可增强机体自身免疫功能，从而促进机体对肿瘤和病毒的免疫反应[8-13]。冰片亦可消炎止痛并促进药物吸收。保妇康栓单独或联合用药已成为宫颈持续性高危型HPV感染的主要治疗手段之一，将保妇康栓置于患者宫颈内部，莪术油可活血化瘀、清热解毒，提升局部免疫力，增加巨噬细胞吞噬能力，去腐生肌，消灭HPV及多种致病菌，促进鳞状上皮细胞生长，修复炎症损伤，促进康复[6-7]。

肿瘤的发生、发展与细胞增殖和凋亡异常密切相关，因此，临床治疗肿瘤重要的策略之一就是诱导、促进肿瘤细胞凋亡。因此，本研究选择HPV16阳性人宫颈鳞癌细胞系SiHa细胞作为研究对象，通过CCK8实验发现，保妇康栓含药血清能抑制SiHa细胞增殖；流式细胞分析结果显示，保妇康栓含药血清作用后可引起SiHa细胞中G0/G1期细胞显著增多，S期细胞显著减少，周期阻断于S期，即细胞的DNA合成期，以致细胞不能进入下一个周期，细胞增殖减少，凋亡增加。以往有研究表明，莪术油的主要成分姜黄素和榄香烯对肿瘤细胞周期具有抑制作用[10,14-15]。说明保妇康栓含药血清能抑制SiHa细胞增殖的作用机制可能是由于药物诱导了细胞的凋亡程序。