两步和三步法分离样本资源库抗凝血单个核细胞和血浆效果比较

丛 佳，徐 杰，代艳超，王子康，孙坚萍

(1.首都医科大学附属北京同仁医院血液内科，北京 100730；2.首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069)

转化医学[1-2]是目前医学研究中的重点和热点，而样本库资源库则是转化医学研究的基石和重要组成部分。早在2009年北京市科委正式启动疾病资源库项目建设工作。北京佑安医院以肝炎、艾滋病等传染病人群为主体，建立了肝炎/艾滋病传染病样本资源库[3-6]。在样本资源库中外周血单个核细胞(PBMC)和血浆是样本资源库储存的重要样本。PBMC包括B细胞、T细胞、NK细胞，单核细胞等，在评价免疫反应中至关重要[7]，在疫苗研究[8-9]和临床试验中也具有重要意义[10-11]；而血浆中各种细胞因子对评价机体炎性反应、肿瘤发生及转移等具有重要作用。在样本资源库中对送检标本如何处理会影响标本的质量。为更好地对标本进行质量控制，从而有利于后期科学研究，本研究比较了两步和三步法分离外周血PBMC和血浆的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集首都医科大学附属北京佑安医院2017年2月至2017年4月送入样本资源库的标本，标本来源者均已签署知情同意书。均为当天采集的新鲜抗凝血，无手术期输血、输液等干扰分离效果的标本。

1.2分离外周血PBMC和血浆的方法 用乙二胺四乙酸抗凝管(货号367525，BD公司)采集外周血6～8 mL，将送检标本混匀后平均分为2份。一份标本直接加入到Ficoll淋巴细胞分离液(货号AS1114546，Axis-Shield公司)中，2 200 r/min离心20 min后进行分离PBMC和血浆提取，即两步法。见图1A。一份标本2 200 r/min离心7 min后先提取血浆，再加入预温的1640培养基(货号SH30809.01B，Hyclone公司)稀释到原来体积，加入到淋巴细胞分离液中2 200 r/min离心20 min后分离PBMC，即三步法。见图1B。分离的PBMC加入适量RPIM-1640混合均匀洗涤后进行细胞计数，而血浆放置于-80 ℃冰箱备用。

注：A表示两步法；B表示三步法

图1不同处理方法示意图

1.3细胞计数 采用吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)染液(货号CS2-0106-5ml，Nexcelom公司)对细胞进行计数，AO为浸润性染料(膜通透性)，可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光、与单链DNA(变性DNA)结合发出红色荧光；PI为排斥性染料(膜不通透性)，不能进入活细胞，与死亡或正在死亡(膜通透性改变)的细胞核酸结合，发出红色荧光。AO/PI双染色可区分活细胞与死亡细胞。具体操作：取PBMC悬液20 μL，与AO/PI染料按1∶1比例混匀；取20 μL混匀液加入到细胞计数板(货号SD100，Nexcelom公司)中，然后插入到自动细胞计数仪(cellcounter，Nexcelom公司)中，自动计数活细胞数、总细胞数和细胞活性。

1.4检测血浆中细胞因子水平 将冻存的血浆解冻后选取能评价炎症、免疫状态、肿瘤发生的27种血浆细胞因子，见表2。利用美国Biorad公司试剂盒进行检测。根据试剂盒操作说明书采用Luminex高通量技术进行检测，检测仪器为美国Luminex 200液相悬浮芯片系统。

2 结 果

2.1不同方法分离PBMC效果比较 2种方法分离的活细胞数、总细胞数及活细胞比例结果相近，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同方法分离PBMC效果比较

2.2不同方法对血浆细胞因子水平的影响比较 两步法血浆细胞因子水平均低于三步法，除GM-CSF和IP-10外，其余25种细胞因子比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同方法对血浆细胞因子水平的影响比较

续表2 不同方法对血浆细胞因子水平的影响比较

3 讨 论

由于样本资源库中的临床样本是不可再生的宝贵资源，而高质量临床样本对科学研究具有极其重要的意义[12]。如何科学、高效、标准化地采集、处理、储存高质量样本资源，建立高质量资源库，使之更好地为转化医学服务至关重要[13]。样本资源库中标本分离方法对标本质量影响较大，本研究比较了两步和三步法对PBMC分离和血浆细胞因子水平的影响。

从操作方面看，两步法处理时间短，操作少于三步法。但在PBMC分离效果方面，在活细胞数、总细胞数及活细胞比例方面，两步法与三步法的结果基本一致，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示在分离PBMC时可采取两步法，这样操作少且省时。也有研究对不同PBMC分离技术方法进行了比较，为利用PBMC而进行的下游应用研究提供了基础，从而可选择最佳PBMC分离方法[15]。

本研究比较了2种方法分离后的血浆细胞因子水平，结果显示，两步法分离血浆中的细胞因子水平均低于三步法，其中25种细胞因子比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，从表2可见，采取两步法分离的血浆大部分细胞因子水平仅为三步法的2/3，甚至更低，这种差异会对后期研究造成极大影响。究其原因，可能在于两步法分离的血浆，因为在分离血浆前就加入了淋巴细胞分离液，从而影响了血浆细胞因子水平，具体机制尚不清楚，有待于进一步的验证研究；而本研究中无论是两步法还是三步法，均采用了先进的Luminex高通量技术，其差异应该与检测技术无关；而检测的27种细胞因子则涵盖了能反映炎症、肿瘤发生及转移等的各种白细胞介素、细胞集落刺激因子、干扰素、血管生长因子等，则2种方法之间的差异也应该不是细胞因子的选择差异所致。提示如后期研究涉及血浆细胞因子水平，那么样本库标本的血浆分离应采用三步法进行处理。

有研究观察了不同处理时间、不同处理温度等条件对血浆收集的影响，结果显示，代谢产物与时间相关，随时间延长，代谢产物会增多，故建议分离血浆应在3 h内进行，在该时间段内代谢产物数据很稳定[14]。由此可见，在不同实验条件下分离的血浆质量会有很大差异。

4 结 论

本研究结果显示，两步法与三步法比较，在分离和收集PBMC方面效果类似，且步骤简单，可节省时间；但两步法分离的血浆细胞因子受到很大影响，不能真实地反映血浆细胞因子水平。