非酒精性脂肪性肝病相关动物模型研究进展

沈李婷 陈东风 文良志

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成为全球慢性肝病最主要的病因。随着生活水平的提高，NAFLD的患病率呈逐年升高趋势,在亚洲已达到25%[1]。NAFLD以无过量酒精摄入但出现肝细胞脂肪变为主要特征,通常伴随有肝外代谢相关疾病，如肥胖，血脂异常，胰岛素抵抗。大量的证据表明，NAFLD相关疾病包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、NAFLD相关肝硬化和肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，还与心血管事件，慢性肾脏疾病，结直肠癌和其他肝外疾病的发生风险增加相关[2]。近年来，已有多种NAFLD动物模型应用于相关研究之中，我们对目前实验研究中常用的动物模型进行了归纳分析，旨在为相关研究的动物模型选择提供便利。

一、NAFLD动物模型

(一)高脂饮食(high-fat diet, HFD)HFD是诱导小鼠NAFLD的常用饮食。经典的HFD包含71%的脂肪，11%的碳水化合物和18%的蛋白质。动物总卡路里摄入量45%～75%来自脂肪。有文章报道，雄性小鼠用HFD喂养16周后，出现以下情况：①体质量增加；②肝细胞脂肪变性，表现为甘油三酯水平升高、肝细胞气球样变和Mallory小体形成；③高糖血症和胰岛素抵抗，表现为血清葡萄糖水平升高和胰岛素水平升高[3]。因此，HFD喂养的动物模型能够很好的模拟临床NAFLD患者的发病机制和组织病理表现。但是该模型的缺点是耗时长(12～16周)，肝脂肪变性程度较轻，且很少出现炎症及纤维化，难以构建NASH相关模型。除了常见的HFD诱导NAFLD小鼠模型外，还有自助餐饮食(cafeteria diet, CAF)用于构建NAFLD小鼠。

(二)自助餐饮食 CAF是一种参照西方文化，能够模拟人类饮食习惯的方法，Brante P. Sampey等[4]分别通过CAF，基于45%猪油的HFD和正常饮食喂养雄性Wistar小鼠15周，观察到CAF喂养的小鼠体质量增加程度，高糖血症、高胰岛素血症和脂肪组织炎症程度均重于HFD饮食和正常饮食小鼠。CAF模型与HFD模型相比，能更好的研究西方饮食结构下导致的肥胖及肥胖相关疾病的发病机制。

(三)瘦素缺失小鼠(ob/ob小鼠)Ob/ob小鼠也是常用于NAFLD研究的动物模型。瘦素由脂肪细胞产生，它参与下丘脑对摄食行为的调节，通过增加饱腹感以减少食物的摄入。Ob/ob小鼠因瘦素合成障碍，表现为懒惰、贪吃和过度肥胖，肝细胞出现脂肪变性，同时伴有高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症和肠菌过度增殖。这类动物模型的缺点是在无外加条件下很难自发发生NASH和肝纤维化。最重要的是，在人类NAFLD中，血清瘦素通常呈现升高的状态。因此，ob/ob小鼠需要一些外加刺激来模拟人类NAFLD/NASH发生，如予以ob/ob小鼠含果糖和胆固醇的高脂饮食，此时不但可以诱发肝脏的脂肪变性、炎症和肝细胞气球样变，还可以导致肝纤维化发生[5]。

(四)瘦素受体缺失小鼠(db/db小鼠)db/db小鼠是常染色体隐性遗传糖尿病基因(db)纯合小鼠。 该小鼠表现为血清瘦素水平不同程度的升高但瘦素信号缺失。db/db小鼠生理及病理生理方面与ob/ob小鼠类似，通常用来构建NAFLD以及糖尿病模型。由于在正常饮食的情况下db/db小鼠不能自发出现NASH相关病理特征，因此，多数研究通常利用MCD饮食予以db/db小鼠第二次打击来构建NASH。另有研究发现，予以db/db小鼠过量铁负荷，使肝脏氧化应激，炎症反应增加，促进肝脏炎性免疫细胞活性，影响肝细胞线粒体脂肪酸β氧化，最终使小鼠出现肝细胞气球样变和肝纤维化。即过量铁负荷使db/db小鼠从NAFLD进展成NASH和相关纤维化[6]。

二、NASH动物模型

(一)甲硫氨酸-胆碱缺乏饮食(Methionine-and choline-deficient diet, MCD)MCD是构建NASH小鼠模型常用饮食，通常由蔗糖(40%的能量)和脂肪(10%)组成，但是缺乏甲硫氨酸和胆碱[7]。甲硫氨酸和胆碱是重要的甲基供体，肝细胞完整的甲基化能力对于一些重要生理功能的维持十分重要，如脂代谢。因此，MCD诱导小鼠发生NASH可能与肝脏合成甘油三酯(如VLDL)功能损害以及随之而来的脂质堆积导致肝细胞氧化应激增加有关[8]。该模型的主要优点是MCD喂养第2周小鼠就会发生广泛的肝脏炎症，并且在6周后出现明显的纤维化[9]，比起HFD，MCD诱发的氧化应激、炎症和纤维化更严重，更能模拟临床病情较重的NASH患者。但是MCD喂养的小鼠会发生明显的体质量下降，血糖水平下降和胰岛素敏感性增加[10]，这与大部分NAFLD患者临床表现不一致。此为MCD诱导NASH模型的缺点。

(二)胆碱缺乏L-氨基酸饮食(Choline-deficient L-amino acid-defined diet, CDAA)CDAA中，蛋白质由等效的L-氨基酸替代，组成配方为：28.9 kcal/g L-谷氨酸，15.8 kcal/g L-天冬氨酸，12.7 kcal/g L-精氨酸和10.5 kcal/g L-亮氨酸，不包含酒石酸氢胆碱。与人类NASH相比，MCD动物模型缺乏血清脂肪酸的升高，并且出现体质量的下降，CDAA动物模型通过改变饮食组成，提升了和人类NASH病理生理的相关性。与MCD动物模型类似的是，它可以抑制肝细胞的脂肪酸氧化，增加脂质合成，氧化应激和炎症，最终导致纤维化；区别在于在长时间的CDAA喂养后(大约22周)，小鼠可出现肥胖，胰岛素抵抗和血清甘油三酯与胆固醇水平升高[11]。也有报道指出在更长时间的CDAA喂养之后(9个月)，小鼠出现不经历肝硬化的NAFLD相关肝癌(成瘤率40%)[12]。CDAA喂养小鼠出现代谢相关症状的时间长，单独应用于NASH研究不多。

(三)胆碱缺乏-高脂饮食(Choline-deficient high-fat diet, CD-HFD)CD不同于MCD，其饮食组成中甲硫氨酸无明显减少，避免了过度的体质量下降，但是大多数CD构建的动物模型仍缺乏明显的肥胖，也不出现糖耐量的改变和胰岛素抵抗。为解决上述问题，学者联合应用了CD、HFD构建NAFLD相关动物模型，该饮食组成为20%蛋白质，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加胆碱。此时，实验动物能在短时间内(一般为6～12周)发生NASH，同时伴随血清转氨酶升高。有学者在一定时间内(12个月)通过CD-HFD喂养，成功在小鼠中诱导出了NAFLD相关的HCC[13]。该模型最大的缺点是纤维化发生缓慢，成瘤周期长(12个月)，并且成瘤率低(25%)。

三、NAFLD相关肝癌模型

单纯饮食诱导NAFLD相关HCC动物模型虽有报道[12-14]，但是此类模型的普遍缺点是造模时间长，成瘤率低。因此，在一般实验研究当中除了运用特殊饮食，还会使用一些特殊小鼠，或者加用某些药物/毒物以模拟NAFLD相关HCC。

(一)HFD喂养MUP-uPA小鼠 MUP-uPA小鼠是一种能在肝细胞中特异性地大量表达尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator, u-PA)的小鼠(6周龄)，大量的u-PA能够引起肝细胞内质网应激和肝脏损伤，这两者都与人类NASH进展相关[15]。Hayato Nakagawa等[16]予以MUP-uPA小鼠(6周龄)HFD喂养，小鼠能在整个观察期间维持高血清转氨酶水平，并在24周内诱导出NASH，32周后出现肉眼可见的肿瘤灶，成瘤率85%。该小鼠模型有肝细胞气球样变、炎症浸润、细胞周围及桥接纤维化表现，同时伴随持续的肝细胞死亡和代偿性增殖，这很好的模拟了人类NASH的病理生理以及NASH进展成HCC的过程。因此非常适用于NASH相关研究。

(二)PTEN基因敲除小鼠 PTEN被认为是一种抑癌基因，在许多人类肿瘤当中存在突变。肝细胞特异性的PTEN敲除小鼠肝脏发生脂肪样变，同时伴随着肝细胞气球样变、Mallory小体形成、小叶炎症和细胞周围纤维化，在74～78周时，83%的雄性小鼠和50%的雌性小鼠诱导出了NASH相关HCC[17]。该模型因此常用来探索NASH以及相关HCC进展的机制。但是肝细胞特异性PTEN敲除小鼠表现出胰岛素高敏感状态，并且不发生肥胖，这是与人类NASH及相关HCC发生过程中相悖的地方。

(三)链脲霉素联合HFD 链脲霉素(streptozotocin, STZ)是一种抗肿瘤药物，其对胰岛β细胞具有毒性作用，可以导致胰岛炎症和损伤，引起胰岛素分泌障碍，从而诱发糖尿病。Masato Fujii等[18]对出生2 d的C57BL/6J 雄性小鼠皮下注射200 μg STZ，出生4周后予以HFD喂养，该模型在HFD喂养后第2周即出现肝脏炎症，气球样变及纤维化，在喂养后第16周形成肉眼可见的肿瘤，成瘤率100%。但当利用相同条件处理雌性小鼠时，小鼠仅出现糖尿病症状而无肿瘤发生。这是多数小鼠模型中存在的问题，即通常只有雄性小鼠才能诱导出较为理想的NAFLD相关表型。但总体而言，STZ注射联合HFD喂养的小鼠成瘤时间短，成瘤率高，是实验研究中常用的NAFLD-HCC动物模型。

(四)四氯化碳联合CDAA 四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)具有肝毒性，在经肝脏代谢后增加了肝细胞的氧化应激，从而导致脂质和氧化产物的堆积以及强烈的炎症反应，最终引起肝纤维化。单独使用CCl4不能引起肥胖，胰岛素抵抗，本身并不适用于构建NAFLD相关动物模型。因此常常结合一些特殊饮食。CCl4联合CDAA是一种常见的用于模拟NAFLD-HCC的形式，CDAA喂养C57BL/6小鼠(6～8周龄)，每周腹腔注射CCl40.2μl/g ，9个月时成瘤率100%。该模型的缺点是造模时间较长，且动物肝脏纤维化程度过重[12]。

(五)二乙基甲硝胺联合HFD或ob/ob小鼠 二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)是一种研究常用的致癌制剂，它能够引起肝细胞氧化应激和DNA突变，增强脂毒性，加速肝脏纤维化和肝硬化进展，广泛用于构建HCC动物模型。通过结合特殊饮食或者特殊基因型小鼠，就能够模拟NAFLD基础上HCC的发生。Eek Joong Park等[19]予以野生型和ob/ob 小鼠(14 d龄)腹腔注射DEN25mg/kg，4周后予以野生型小鼠HFD喂养，ob/ob小鼠低脂饮食，9月后成功诱导出NAFLD相关HCC。

上述模型虽然能很好地帮助我们研究NAFLD相关HCC病理生理，模拟大多数NAFLD患者经历肝纤维化、肝硬化这一晚期阶段再形成HCC的过程[20]，但是人类很少有机会接触到这些具有致癌作用的药物或者毒物，并且NAFLD基础上发生HCC机制复杂，因此上述药物/毒物基础是构建的动物模型最大的缺点就是与人类成瘤病因不同。

四、总结与展望

NAFLD现今仍无精准有效的治疗手段，因此临床上迫切的需要在阐明其中发病机制的基础上，找到和确认新的药物干预治疗靶点。动物模型是一种不可或缺的研究工具。本文总结了目前常用的动物模型，分析了模型各自的优缺点，为学者获得高质量研究成果提供保障。