药物性肝损伤潜在的新型生物标志物：细胞外囊泡

金银鹏 王皙 傅青春

药物性肝损伤(DILI)可致急性肝功能衰竭甚至死亡，迄今仍缺乏敏感、特异的诊断标记物。如何早期识别并干预，及时更改用药方案以避免持续性肝损伤，具有重大临床意义。目前临床常用肝损伤指标如血清ALT、AST等对DILI的诊断缺乏特异性，且在肝组织损伤较重时才有所变化，蛋白质组学、代谢组学等研究发现胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)来源的某些microRNA、mRNA、蛋白质、代谢物等在DILI中变化较传统肝损伤标志物更早，提示EVs具有早期诊断DILI的价值。本文将从EVs内所含RNA和蛋白质作为DILI早期诊断的新型生物标志物进行综述，为DILI的早期诊断提供思路。

对乙酰氨基酚(APAP)、异烟肼、氟烷等多种药物均可诱导DILI的发生[1]。其发病率取决于药物潜在的肝毒性及宿主的生理状态，如营养不良、肥胖、前驱糖尿病及慢性饮酒等。DILI患者6个月死亡率或接受肝移植率可达10%以上，其余患者仍有20%存在持续性肝损伤。传统的DILI诊断生物标志物ALT、AST等的升高与肝细胞死亡密切相关，但其组织特异性差，ALT的异构体ALT1、ALT2在肾脏、肝脏、脂肪和肌肉组织中也可高表达[2-3]。此外，肝酶的升高晚于肝组织的病理变化，无法对DILI进行早期诊断。

近年来，蛋白组学技术的发展推动了DILI生物标志物研究进程。研究发现肝细胞来源的EVs可作为DILI诊断的生物标志物。EVs包含多种功能性物质，如蛋白质、RNA(包括mRNA、microRNA、IncRNA和其他RNA)、DNA(mtDNA、ssDNA、dsDNA)、脂质及完整的细胞器(线粒体)等。根据EVs来源，可分为凋亡小体(直径50 nm～5 μm，细胞凋亡后形成，代表细胞碎片)、微囊泡(直径50～1 000 nm，细胞膜向外出芽裂变形成)及外泌体(直径40～100 nm，细胞膜向内出芽裂变形成)。细胞分泌的EVs可直接作用于周围细胞或通过血液、尿液、唾液等多种途径进行远距离作用。EVs可通过表面分子抗原抗体反应与受体细胞结合，或非特异性内吞作用进入受体细胞释放所含物质，改变受体细胞生理或病理过程[5]。EVs可反映起源细胞类型及病理生理状态。本文从EVs所含蛋白、RNA或代谢物等物质作为DILI早期诊断的生物标志物进行阐述。

一、各类EVs的起源及特征

不同细胞或器官来源的EVs存在明显的异质性。EVs可根据大小和密度分为大、中、小EVs。不同类型EVs的表面分子表达具有共性也有差异性，例如：各类EVs均表达I/II型主要组织相容性复合体(MHC-I/-II)及热休克蛋白70(HSC70/HSP73和HSP70/HSP72)，然而GP96及应激相关蛋白质仅在大型EVs中表达，actin-4及其他线粒体蛋白质在小型EVs中不表达。此外，synteinin-1、TSG101、ADA10及EHD4仅表达于小型EVs。

小型EVs(外泌体)是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的膜性脂质囊泡，透射电镜下可见典型的“杯口状”形状。外泌体所含共性蛋白质主要来自细胞膜、高尔基体和内质网等生物膜。如内源性蛋白(MVBs)、四跨膜蛋白超家族(如CD63、CD9 和CD81)、微管蛋白、热休克蛋白(HSP70、HSP90)等。以上保守型蛋白质可帮助外泌体渗透、入侵及融合入靶细胞及外泌体鉴定。如：B细胞来源外泌体四跨膜蛋白超家族(CD37、CD53、CD63、CD81、CD82)表达多达7～124倍，这些蛋白质是细胞质膜和早期核体的标志[14]。细胞受损时分泌的外泌体所含物质发生变化。外泌体所含物质参与靶细胞的生理或病理过程，如：免疫反应、肿瘤转移、蛋白清除及基因交换等。

微囊泡是细胞膜向外突起后断裂释放入周围环境的囊泡，此过程类似于细胞分裂的最后一步。研究发现，微囊泡的脱落机制包括脂质聚合不对称、细胞内钙信号刺激及膜弯曲蛋白对膜弯曲的影响等等。如ESCRT-1蛋白与抑制蛋白(arrestin)直接作用促进微囊泡释放；细胞发生应激反应时，细胞内钙水平升高促进微囊泡的释放；此外，pro-caspase3刺激Rho相关蛋白激酶1促进了凋亡的发生，诱导肌凝蛋白收缩从而释放微囊泡[6]。

二、EVs内RNA可用于DILI早期诊断

研究发现，非侵入性(尿液和唾液)及微创性(血液)体液来源的EVs可实时反映肝组织的病理变化，其所含物质可作为DILI早期诊断的相关生物标志物。EVs内所含蛋白、RNA或脂类以不同方式参与DILI发生及发展过程，其中microRNA与肝组织炎症、应激及免疫反应有关[18]。人类白细胞抗原基因型是广泛药物发生DILI的危险因素，说明适应性免疫反应在DILI的发生中具有重要作用。发生DILI时，肝细胞来源EVs携带受损肝细胞中修饰过的物质透过肝窦进入血液循环，如microRNA-155、高迁移率族蛋白1(HMGB1)以及乙酰化的HMGB1在EVs中高表达。肝细胞死亡时，外泌体携带损伤相关分子模式(DAMPs)、抗原及细胞因子进入受体细胞，释放microRNA、mRNA等激活免疫反应，外泌体内microRNA-122及白蛋白mRNA激活单核细胞及成纤维细胞。可见肝细胞来源外泌体通过释放肝细胞损伤信号直接或间接参与DILI免疫反应。

炎症反应在DILI中可造成严重的肝组织损伤，炎性反应的严重程度与巨噬细胞分化表型明显相关，大巨噬细胞(THP-1)可分化成M1型或M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α及NO合成酶等物质促进炎症的发生，而M2型巨噬细胞可抑制炎症的发生、发展。EVs内多种物质可影响THP-1的分化，例如EVs内microRNA-99a抑制THP-1分化成M1型巨噬细胞的同时促进其向M2型巨噬细胞分化[7]。此外，microRNA-106b可促进Th17细胞分化及炎症因子的释放，加重肝组织的炎症反应；microRNA-491-5p可抑制NFκB的表达，减弱NFκB下游信号因子TNF等对肝组织的损伤。研究发现microRNA-223的缺失加重了肝组织中性粒细胞的浸润、氧化反应及肝毒性。相反，microRNA-223的过度表达明显减弱了炎症反应导致的肝组织损伤。体内研究发现，暴露于毒性剂量APAP时可增加微粒子(MPs)及外泌体内mtDNA表达，肝细胞经MPs预处理后，中性粒细胞内microRNA-223表达量显著增加，然而，敲除toll样受体9(TLR9)的中性粒细胞microRNA-223则无变化。表明TLR9在中性粒细胞介导的炎症及肝损伤中具有重要作用。以上研究表明，EVs内所含物质可调节DILI肝组织的炎症反应，加重或减轻肝组织损伤。

APAP诱导的急性肝损伤小鼠模型中，循环中肝细胞来源的EVs升高明显早于ALT、AST等肝酶，并且EVs内肝组织特异性microRNA-122及炎症相关microRNA-155显著升高。体外评估发现，外泌体形式microRNA比游离状态更稳定，因此，外泌体形式microRNA可更好地作为DIIL早期诊断的相关生物标志物。相似的，中毒剂量APAP诱导大鼠发生急性肝损伤时，大鼠肝组织发生大量小叶中心坏死， ALT、AST等肝酶显著升高，肝细胞来源EVs明显增加，且EVs内肝组织特异性microRNA-122呈倍数增加。肝组织损伤早期，促进抗氧化基因表达的microRNA-298/-370明显下降，促进了肝损伤的发生。此外，原代肝细胞暴露于APAP 24 h后，肝细胞分泌的外泌体内白蛋白mRNA、microRNA-122明显增高，而细胞质中microRNA-122无变化。

各类细胞分泌的EVs所含microRNA变化具有组织特异性，APAP诱导的急性肝损伤小鼠模型中，肝细胞来源EVs明显增加，且肝细胞损伤相关microRNA-122、 microRNA-192及microRNA-155显著增加，而肌肉特异性microRNA-206或肾特异性microRNA-146a变化很小。急性肝损伤小鼠经抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理后，EVs内microRNA-122、microRNA-192及microRNA-155峰值明显下降，且可恢复至基线水平，提示NAC几乎完全阻止了APAP诱导的肝毒性。肝毒性药物烯丙醇α-萘基异硫氰酸酯诱导大鼠发生肝损伤时，microRNA-122显著升高，而非肝毒性药物阿霉素不能使肝源性microRNA-122、microRNA-192表达升高。此外，异烟肼诱导的DILI动物模型中，肝组织特异性microRNA-122表达也明显增加。体外评估发现，microRNA-122在肝组织的表达量高达72%。肝组织特异性microRNA-122作为肝损伤相关标志物得到广泛证实。这些结果表明，EVs内microRNA可以作为DILI早期诊断的特异性生物标记物。

肝移植患者发生急性排斥反应时，循环EVs内肝组织特异性microRNA-122/-148a/-194升高明显早于AST、ALT等肝酶变化。对DILI诊断相关生物标志物进行时间及剂量依赖性分析发现， microRNA-122及谷氨酸脱氢酶(GLDH)变化最早。临床研究发现，不同肝病患者肝损伤相关microRNA的变化不尽相同，例如microRNA-574-3p /-193a-5p /-148a/ -345在DILI中显著升高，而慢性丙型肝炎及自身免疫性肝病(AIH)无变化；与健康人群相比，microRNA-345/-483-5p/-193在DILI、慢性乙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中明显升高。与DILI患者相比，慢性乙型肝炎患者血循环内microRNA-374表达量明显下降；相似的，与DILI、HBV及NASH患者相比，microRNA-19a/-19b/-266在慢性丙型肝炎患者明显下降，以上研究表明，EVs内不同肝组织特异性microRNA的变化可作为不同肝疾病诊断的重要生物标志物。[32]然而，microRNA-122的半衰期较短，较其他生物标记物更早恢复到基线值。若明确了APAP暴露后外泌体内microRNA-122变化的时间依赖性，可进一步完善microRNA-122作为DILI早期诊断的价值。

APAP诱导的急性肝损伤大鼠模型中，除microRNA外，循环EVs内肝组织特异性mRNAs也显著升高，升高的程度与AST、ALT等肝酶呈正相关。EVs内所含物质的变化可更早、更稳定地反映肝组织病理变化。EVs内肝组织特异性mRNA是识别肝损伤更具体、更敏感的生物标记物，如：D-gal诱导的急性肝损伤大鼠模型中，EVs内Alb、Gnb2l 及Rbp4基因的mRNA明显升高[8]。综上所述，发生DILI时，EVs内各类RNA可作为DILI早期诊断的生物标志物。

三、EVs内蛋白质及代谢物可用于DILI早期诊断

发生DILI时，肝细胞来源的EVs内蛋白质及代谢物均可发生改变。肝细胞来源的EVs除表达Tsg101、CD63及CD81等外泌体标志蛋白外，也表达肝细胞特异性蛋白质及代谢性疾病相关蛋白质，例如：无唾液酸糖蛋白、膜联蛋白A2(annexin A2)、对氧磷酶-1(paraoxonase-1)、载脂蛋白E(apolipoprotein-E)、邻苯二酚O-甲基转移酶(catechol O-methyltransferase)。细胞色素P450、UDP葡糖醛转移酶、谷硫代转移酶及GST等可参与肝细胞对外来化合物的降解，表明肝细胞来源EVs不仅可作为DILI早期诊断的生物标志物，也参与药物的新陈代谢和清除过程。APAP诱导的急性肝损伤小鼠模型中，肝细胞来源的EVs内肝组织特异性蛋白质表达呈倍数增加。如：肝羧酸酯酶1(CES1)、载脂蛋白A-1(APOA1)、乙醇脱氢酶-1(ADH1)、GST、白蛋白(Alb)、结合珠蛋白(HP)和纤维蛋白原(FGB)。与ALT相比，EVs内蛋白质的变化显示出对APAP的剂量及时间依赖性。这些结果表明，肝细胞来源的多种蛋白质或蛋白酶能以EVs的形式参与细胞对脂质或外来化合物的代谢。

与对照组相比，原代肝细胞暴露于APAP或双氯芬酸后，细胞分泌的EVs内多种氨基酸、磷脂及磷酸亚胺代谢物发生了改变。如：L-谷氨酸、α-亚麻酸、十五烷酸及9- 10-二羟基-十八烷酸的表达显著升高。其中9-10-二羟基-十八烷酸、细胞色素CYP2C、CYP2E1及CYP3A4是亚油酸的代谢产物，支持9-10-二羟基-十八烷酸是肝细胞来源EVs的组成成分[9]。EVs内代谢物的改变可损坏机体的生理功能。例如：啮齿动物暴露于APAP后，循环EVs内NO酶前体(L-精氨酸)的减少减弱了血管内皮细胞生理功能的维持。相似的，EVs内精氨酸酶的增加诱导了肺血管性高血压的发生[10]。以上研究表明，肝细胞来源EVs可参与血管内皮调节、氧化还原及能源供应等新陈代谢，促进或抑制DILI的发生、发展。

特异性器官发生损伤时，只有特异序列或选择性microRNA在EVs内的表达明显增加。例如顺铂诱导的肾损伤小鼠模型中，尿液来源的EVs内肾损伤分子-1(KIM-1)及中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白等肾源性蛋白质明显增加；环磷酰胺(CPP)诱导的心肌损伤小鼠模型中，循环EVs内心肌特异性肌钙蛋白(cTnI)明显升高；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的神经损伤小鼠模型中，循环EVs内神经特异性蛋白-S100-钙结合蛋白B(SB)明显升高。EVs内所含物质具有组织特异性，可作为特异性器官损伤诊断的潜在生物标志物。

线粒体为细胞活动提供能量，是细胞参与抗氧化、脂肪酸氧化、代谢及死亡相关的重要器官。细胞发生各种应激后可释放线粒体囊泡，线粒体囊泡(MDVs)是由线粒体外膜、内膜及基质中蛋白质选择性结合生成。MDVs包含II/III/IV型氧化磷酸化复合物，而不包含I/V型蛋白及任何核酸类物质，说明线粒体物质组成的特殊性，氧化反应可诱导蛋白发生构象改变并嵌入MDVs。近期一个报道称阿霉素诱导心功能发生损伤时，线粒体出现自噬且MDVs数量显著增加，提示MDVs可能是心肌及线粒体对抗应激反应的第一道防线。线粒体参与多种疾病的发生及发展，然而我们并不知道是否MDVs也参与DILI的发病及进展。因此，线粒体来源的MDVs在DILI中的功能机制需要进一步研究。

四、EVs作为DILI早期诊断生物标志物的优势与缺点

药物组学、蛋白质组学及代谢组学促进DILI早期诊断相关生物标志物的发展，研究发现，microRNA、细胞角蛋白18(CK18)及HMGB-1等多种生物化合物参与DILI发生、发展。其中组织特异性microRNA已成为多种器官损伤高度敏感而特异性强的生物标记物。肝组织特异性microRNA-122是DILI早期诊断的重要生物标记物，其中EVs形式microRNA-122价值最大。EVs可反映来源细胞的生理病理状态，且EVs稳定性强、半衰期时间长等优势增加了其在DILI中的检测时间窗。然而，EVs作为疾病诊断的生物标志物仍存在一定的局限性，样本收集及储存、分离方法及后续提取RNA缺乏标准方法。目前EVs的分离方法包括离心法、密度梯度法、沉淀法及微滤法等，这些分离方法提取的EVs数量、类型和纯度不一致。循环EVs储存时间过长会增加EVs的破裂及降解；尿液来源的EVs受氯化钠及丙硫醇昼夜变化的影响，不同时间点提取的EVs所含物质不尽相同。

体内外研究均发现，循环EVs有助于诊断包括DILI在内的多种肝组织损伤。EVs通过调节细胞功能、激活受体细胞不同信号途径促进或抑制各类肝损伤的发生、发展。然而，由于EVs所含物质多样化，实验室环境、条件及分析方法等不同因素的影响，使得EVs缺乏标准化使用方法。目前肝细胞来源的EVs分离主要依赖免疫吸附等非特异性浓缩法，EVs提取方法耗时过长，分离出的EVs质量差。因此，改进不同体液来源EVs的提取方法，分离出可靠、高质量的EVs有助于包括DILI在内的多种疾病的早期诊断，最大化体现EVs应用价值。