奶粉中沙门氏菌检测能力验证分析

游元丁，赵 阳，徐孟怀，冉茂乾，李 志，焦彦朝

(1.六盘水市山地特色生态产品研究中心，贵州六盘水 553000；2.国家果蔬检测重点实验室(六盘水)，贵州六盘水 553000；3.贵阳海关出入境检验检疫综合技术中心，贵州贵阳 550081)

实验室一般通过内部质量控制、能力验证或使用实验室间比对等方式来评估检测人员的能力，对检测人员的资格进行确认。能力验证活动是利用实验室间的比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[1-2]。中国合格评定国家认可委员会(CNAS)2018年发布实施的CNAS-RL02：《能力验证规则》[2]中明确规定了实验室参加能力验证的最低要求，其中食品领域中微生物的最低参加频次为1次/年，可见能力验证活动已成为我国实验室认可机构采用的主要技术手段之一。微生物实验室质量控制的关键环节也是能力验证活动，能力验证结果直接影响到检验报告的准确性和质量[3]。而沙门氏菌作为常见致病菌，是很多食品安全的必检项目，也是实验室微生物检测的常规致病菌，其与人的生活环境以及人体饮食健康息息相关[4]，因此沙门氏菌的检测能力和技术水平至关重要，实验室通过参加沙门氏菌能力验证，验证实验室是否具备检测沙门氏菌的技术能力，确保检测活动的有效性[5]。

沙门氏菌是一种常见的人畜共患病原菌，属肠杆菌科、革兰氏阴性杆菌，其能引起人类的伤寒、副伤寒、败血症及场外灶性感染等多种症候群，严重危害人类健康[6-7]。国家果蔬检测重点实验室(六盘水)2018年参加由中国认证认可监督管理委员会(CNCA)组织的、中国检验检疫科学研究院测试评价中心负责实施的A类项目“奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测(CNCA-18-A07)”中沙门氏菌的检测，实验室编号为CNCA-18-A07-214。根据国标法[8]对2个奶粉样品进行检测，检测过程中用VIDAS进行初筛，生化试剂盒和全自动微生物鉴定仪(VITEK 2 COMPACT)进行生化鉴定。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源。2份奶粉样品由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，编号分别为18-Q018和18-W430。

1.1.2培养基及试剂。缓冲蛋白胨水预增菌液(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)、亚硫酸铋(BS)、沙门氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、营养琼脂(NA)、HE分离培养基、沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒等均购自北京陆桥技术股份有限公司；SLM沙门氏菌检测试剂盒(VIDAS)、VITEK 2革兰氏阴性细菌鉴定卡购自生物梅里埃公司；沙门氏菌诊断血清套装购自天津生物芯片技术有限公司。所有培养基和试剂均验证合格且在有效期内。

1.2试验方法

1.2.1样品处理。收到的样品为西林瓶包装，需用100 mL稀释液再水化，具体操作如下：先用4 mL稀释液进行再水化，待冻干粉充分溶解后，用无菌吸管转移至无菌瓶中，再反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，并将清洗液全部回收至上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，等同于100 mL的待测乳品样品。

1.2.2沙门氏菌预增菌和增菌。在生物安全柜中转移25 mL待测样品至225 mL灭菌的缓冲蛋白胨水(BPW)中，(36±1)℃于恒温培养箱中培养8～18 h；分别吸取1 mL预增菌液转接到10 mL的亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)中和四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)中，SC混合增菌液于(36±1)℃恒温培养箱中恒温培养18～24 h，TTB混合增菌液于(42±1)℃恒温培养箱中恒温培养18～24 h。

1.2.3VIDAS全自动酶联免疫分析仪进行沙门氏菌快速筛选。从SC增菌液和TTB增菌液管中分别移取1 mL增菌液到无菌试管中，将试管于沸水中加热15 min灭活。分别取500 mL增菌液于恢复室温的酶联免疫试剂条测试孔中，经VIDAS 30酶联免疫分析仪检测，45 min后查看报告结果。

1.2.4选择性分离。用3 mm的接种环从“1.2.3”中的SC和TTB增菌液中取菌液1环，划线接种于BS琼脂平板、XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板；BS琼脂平板于(36±1)℃恒温培养40～48 h，XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板于(36±1)℃恒温培养18～24 h，随时观察平板菌落生长情况，记录菌落形态。

1.2.5生化鉴定试验。选取“1.2.4”中的典型菌落明显、分离效果好的2种类型的平板，从平板上挑取菌落转移至营养琼脂平板(36±1)℃培养24 h。为确保生化鉴定结果，同时采用沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒和全自动微生物鉴定仪鉴定。生化鉴定试剂盒使用根据试剂盒说明书，挑取新鲜培养的单个纯菌落接种于三塘铁生化管，同时挑取菌落至适量0.85%生理盐水中，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液，按说明书添加至每个生化反应孔内，盖上盒盖，与三塘铁生化管一起于(36±1)℃培养，氰化钾试验若培养24 h时仍为阴性，延长至48 h后观察结果。全自动微生物鉴定仪(VITEK 2 COMPACT)用0.45%的盐水挑取菌落制成0.50～0.63个麦氏浊度的均匀菌悬液，按仪器作业指导书进行上机鉴定。

1.2.6血清学鉴定。将“1.2.5”中符合沙门氏菌生化反应特征的样品进行血清学鉴定。

多价菌体抗原(O)鉴定：在洁净玻片上的2个分离区域滴加2滴生理盐水，从营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀，滴加1～2滴多价菌体(O)抗血清于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入1滴生理盐水作为对照，用接种环分别混匀玻片上的2种混合液，轻轻摇动玻片1 min，观察结果。

多价鞭毛抗原(H)鉴定：按多价菌体抗原(O)鉴定方法进行操作，滴加多价鞭毛抗原(H)抗血清，观察结果。

2 结果与分析

2.1VIDAS初筛结果分别将2份奶粉样品的增菌液灭活后用VIDAS酶联免疫分析仪进行初筛分析，初筛结果显示，样品18-Q018为沙门氏菌阴性，样品18-W430为沙门氏菌阳性。

2.2选择性平板分离将增菌液划线于多个平板进行选择性分离培养，2份奶粉样品18-Q018和18-W430在各平板上的菌落形态见表1。

表1 选择性平板上菌落形态

2.3生化鉴定结果样品18-Q018在各平板上均没有典型菌落生长，菌落形态判断与VIDAS的初筛结果一致，挑取2个BS平板上黑色带金属光泽菌落，(编号分别为18-Q018-1和18-Q018-2)、1个XLD平板上的黄色菌落(编号18-Q018-3)进行生化鉴定；样品18-W430在各平板上都有典型菌落生长，与VIDAS初筛结果一致，挑取2个沙门氏菌显色培养基平板的紫红色菌落，编号分别为18-W430-1和18-W430-2，1个BS平板的灰绿色菌落，编号为18-W430-3进行生化鉴定。生化鉴定结果见表2。18-Q018-1和18-Q018-2这2个菌落分别用生化试剂盒和全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定，生化试验确认为非沙门氏菌，全自动微生物鉴定仪鉴定为大肠杆菌(Escherichiacoli)；18-Q018-3生化鉴定为非沙门氏菌，生化鉴定结果与VIDAS初筛结果一致，则样品18-Q018 25 mL未检出沙门氏菌。18-W430挑取的3个典型菌落生化鉴定结果皆为沙门氏菌阳性，则25 mL 18-W430样品中检出沙门氏菌。

2.4血清学鉴定结果根据生化鉴定结果，样品18-W430的3个菌落生化鉴定结果皆为阳性，进一步进行血清学确认。挑取18-W430的琼脂纯培养物进行血清学鉴定，鉴定结果见表3。由生化鉴定结果和血清学鉴定结果确定25 mL样品中，样品18-Q018未检出沙门氏菌，18-W430检出沙门氏菌。

表2 样品生化鉴定结果

注：“K”为产碱；“A”为产酸；“+”为阳性；“-”为阴性；”UD”代表未鉴定

Note： “K” is alkali production；“A” is acid production；“+” is positive；“-” is negative；“UD” stands for unidentified

表3 18-W430样品血清学鉴定结果

注：“+”为阳性；“-”为阴性

Note：“+” is positive；“-” is negative

3 结论与讨论

采用传统国标方法检测沙门氏菌，沙门氏菌的选择性分离培养尤其重要，其在各种类型的平板上生长情况不一致，BS平板上生长较慢，培养时间较长。沙门氏菌显色培养基沙门氏菌菌落特征明显，容易识别。尽管国标法中只需要2种不同培养基即可，但是在进行选择性分离时，应选择多种培养基进行分离，有机结合，相辅相证。

样品18-Q018进行VIDAS初筛的结果为阴性，挑取的菌落中分离出大肠杆菌(Escherichiacoli)。样品18-W430除了分离出沙门氏菌以外，选择性平板上还有其他菌落形态，样品中应添加了其他干扰菌。在实验室有时间和条件的情况下，应继续分离，通过继续研究，既可以了解样品污染情况，同时又能提高检测人员的技术能力[9]。

传统国标方法符合食品安全法的强制标准，方法成熟，对菌体浓度要求不高，但是耗时较长。酶联免疫法VIDAS初筛时间较短，但阳性样本还需传统方法确认，在传统国标方法进行的同时采用VIDAS进行初筛，可以提前摸清样本情况，做到心中有数。目前沙门氏菌的检测方法较多[10]，不乏很多快速检测方法，可以采用多种方法进行确认，确保检测结果正确。

实验室通过参加沙门氏菌检测能力验证活动，可以确保实验室沙门氏菌的检测水平和检测质量。参加完能力验证之后，实验室通过开展能力验证分析，提高检测人员检测能力和技术水平，确保检测活动的数据达到检测质量的标准。