几种海滨植物作为产乙醇生物质原料的可能性研究

韩文冰，明凯利，马 跃，吕晋江，张波涛*

(1.青岛大学化学化工学院，山东青岛，266071；2.成都中医药大学药学院，四川成都 611130；3.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛 266042)

随着化石能源渐趋枯竭和环境不断恶化，寻求对环境友好的新能源，走可持续发展的道路已引起各国的普遍重视。植物细胞壁中含有丰富的纤维素多糖资源，利用“绿色生物化工” 技术可将其转化为乙醇等[1]，作为一种可再生的生物资源，具有极高的研究价值和开发利用的现实意义。对生物质原料的研究和开发已成为当前能源领域的一个研究热点。

当前，在“不与人争粮，不与粮争地”的原则下，我国第2代乙醇生物质原料的研究取得了重大进展，主要是以废弃的农作物秸秆(麦秆、稻草秆、玉米秆等)为代表，但仍面临着诸多困难，其中生物质原料的来源及成本，是生物能源发展中的重要瓶颈之一，所以现在科学家把目光投向成本更为低廉、来源更广泛的木质纤维素原料[2]。我国作为一个海洋大国，有着丰富的自然生长的海滨植物，对其进行开发，不仅可极大地丰富生物质原料的来源，同时也可以降低原料成本，具有重要的意义。以秸秆为对照，从纤维成分含量和酸化酶解后的糖含量上对芦苇、海带、浒苔等3种海滨植物作为产乙醇原料的可行性进行比较，并对其中纤维素含量较高的芦苇进行糖化发酵产乙醇的初步试验，为进一步研究提供试验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料芦苇、海带、浒苔等均来自黄海海滨青岛段，玉米秸秆来自河南农业大学，其中芦苇、玉米秸秆为秋季采收的枯秆，海带、浒苔为春夏季收集。

将干燥的芦苇秆、玉米秸秆用粉碎机粉碎，并过40目筛作为试验样品备用；将采集的海带、浒苔洗净除去泥砂及杂质，干燥研碎后，过40目筛作为试验样品备用。

1.2样品成分测定方法对王玉万等[3]和杭怡琼等[4]的方法进行改良，对样品中的纤维素、半纤维素、木质素等进行系统定量分析。

准确称取1 g样品，分别经中性洗涤剂处理、2 mol/L盐酸水解处理、72%硫酸酸化处理、高温灰化处理等连续处理步骤，每步处理后的残渣均干燥至衡重，分别为W1、W2、W3、W4，每个样品成分测定至少3组平行，结果取平均值。用以下公式计算半纤维素、纤维素、木质素含量：

半纤维素(%)=(W1-W2)/样品重×100%

纤维素(%)=(W2-W3)/样品重×100%

木质素(%)=(W3-W4)/样品重×100%

1.3样品酶解糖化试验方法

1.3.1酶解试验。样品按5 g：100 mL(2%硫酸)的料液量，装入三角瓶中封口，121 ℃高温处理1 h，冷却后，用氢氧化钠溶液调pH为5.0左右。以20 IU/g样品的酶量，加入纤维素酶(测得酶活为35.0 IU)，放入120 r/min、48 ℃摇床中酶解52 h。分别取酶解0 h和52 h的酶解液适量，离心后取上清糖化液，分别测还原糖和木糖浓度。

1.3.2还原糖的测定方法。还原糖含量的测定采用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法[5]。

1.3.3木糖的测定方法。木糖的测定采用地衣酚-盐酸法，具体参考李胤等[6]的方法。

1.4乙醇发酵试验方法

1.4.1酶解发酵试验。样品按10 g：100 mL(2%硫酸)的料液量，酶解48 h后，离心得糖化液。具体方法同1.3.1。

发酵培养基：糖化液、酵母粉0.3%、蛋白胨0.5%、尿素0.02%、磷酸氢二铵0.01%。115 ℃灭菌30 min。发酵条件：酵母(购自安琪公司)活化液接种量10%，温度34 ℃，120 r/min振荡培养。分别在发酵20 h和44 h时无菌取适量的发酵液，离心后取上清液，测定乙醇含量。

1.4.2乙醇测定。采用气相色谱(GC)用外标法对乙醇含量进行测定。气相色谱条件为：进样口温度150 ℃；进样量0.5 mL；载气He2流量1 mL/min；柱温由50 ℃程序升温至100 ℃；FID检测器温度220 ℃；燃气H2流量40 mL/min；空气流量400 mL/min；色谱柱为DB-624，30 m×250 μm×1.4 μm。

2 结果与分析

2.1各样品成分含量由图1可知，芦苇中纤维素和半纤维素含量较高，分别为34.60%和32.60%，高于对照样秸秆的33.60%和29.00%；浒苔中半纤维素的含量较高，达到了39.40%；海带中纤维素和半纤维素的含量均偏低。纤维素和半纤维素作为多糖资源，可以降解为单糖，进而利用单糖发酵产乙醇。以芦苇中纤维素为例计算，在完全理想的情况下，即纤维素完全转化为葡萄糖，产生的葡萄糖完全发酵为乙醇，则10 t芦苇可产生乙醇约1.96 t，即使转化率为50%，也可生成约1 t的乙醇。由此可见，高含量的纤维素、半纤维素体现了芦苇和浒苔具备作为乙醇生物质原料的重要优势，特别是芦苇极其具有开发利用的潜力。

图1 不同样品的纤维成分比较Fig.1 Comparison of fiber composition of different samples

2.2各样品酶解液中还原糖和木糖浓度比较由图2可知，酶解52 h，浒苔和芦苇还原糖含量较高，分别为35.87和31.91 mg/mL。包含在还原糖中的葡萄糖等单糖在合适条件下经普通酵母作用即可产生乙醇，因此利用浒苔和芦苇酶解液中的糖发酵产乙醇具有极大的可能性，可以将浒苔和芦苇作为产乙醇生物质原料进行深入研究。

酶解液中还原糖主要由样品中的纤维素和半纤维素在高温酸化和纤维素酶的作用下产生。而从结果可知，样品酸化酶解后的还原糖含量并不与样品中纤维素、半纤维素含量成相应的关系。如浒苔虽然半纤维素含量较高，但纤维素含量很低，产生的还原糖含量却高于芦苇和秸秆，这可能与它们各自的结构有关。因此，在进一步深入研究芦苇、浒苔等作为产乙醇生物质原料时，还需根据样品的结构特点，选择各自适合的预处理方法和酶解条件以提高糖产量。

图2 样品酶解液中还原糖含量比较Fig.2 Comparison of reducing sugar content in sample

由图3可知，芦苇酶解液中木糖含量较高为13.75 mg/mL，另3个样品酶解液木糖含量均较低。4个样品在酶解过程中木糖含量增长较少，这可能与纤维素酶不能降解木聚糖有关。木糖是除葡萄糖外组成纤维成分的重要单体糖，由木糖形成的聚合物——木聚糖是半纤维素的重要组分，木糖通过特殊的酵母发酵也可以产乙醇。因此，通过比较纤维成分和酶解糖度含量，初步确定芦苇和浒苔可作为乙醇生物质原料，而其中的芦苇优势更高。

图3 样品酶解液中木糖含量比较Fig.3 Comparison of xylose content in sample enzymatic hydrolysate

2.3发酵液乙醇含量根据样品成分和酶解糖度测定结果，对芦苇进行初步的糖化发酵产乙醇试验，并与秸秆进行比较，分别测定各自糖化液发酵20和44 h时的乙醇含量(表1)。发酵20 h时，芦苇产生的乙醇含量为0.43%～0.47%，高于对照样玉米秸秆的0.29%～0.31%，说明芦苇可以作为产乙醇的原料，具有极大的开发利用价值。

表1 样品发酵产乙醇含量

3 结论

纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源，由C6糖通过酿酒酵母发酵生成乙醇是很成熟的工艺[7]。该试验通过对几种海滨植物的成分分析，其中芦苇纤维素和半纤维素含量均高于玉米秸秆，浒苔中也有较高含量的半纤维素。表明芦苇和浒苔作为自然生长的植物具有重要的研究价值。

在糖化试验中，芦苇、浒苔通过酸化酶解，均产生较高含量的糖，在对芦苇初步发酵产乙醇的试验中，产生一定含量的乙醇。试验表明，芦苇、浒苔等可以作为第2代乙醇生物质原料，特别是芦苇具有较高研究利用的价值。

在天然木质纤维素降解产乙醇的试验中，当前仍然面临诸多困难。首先，需要对生物质原料进行预处理，破坏其结晶结构。预处理的效果、成本及对环境的影响是选择不同原料预处理方法的关键因素。该试验中芦苇纤维成分含量高，但相同酸化条件下，酶解后产生的糖并不高，需要通过优化选择合适的预处理工艺方法。目前，用于植物木质纤维素原料预处理的方法包括：物理化学方法、液氨冷冻爆破法、超临界CO2法和微波处理等[8]，如杨培周等[9]将超声波法和稀H2SO4相结合进行预处理能提高纤维素酶酶活。其次，在酶解糖化时，纤维素酶酶活低及酶解液中可能存在对酶解及发酵有抑制性的物质等，如宋晓川等[10]研究比较几种纤维降解产物对酵母发酵的毒性大小，分别为：甲酸>乙酸>糠醛>羟甲基糠醛。此外，半纤维素降解后能产生大量木糖，该试验可以看到芦苇糖化液中也有较高含量的木糖，而当前市售的酿酒酵母是不能利用木糖的。当前，能同时利用木糖和葡萄糖发酵的酵母正处于实验室研究阶段，如孙博等[11]通过基因工程手段将能利用木糖的树干毕赤酵母相关基因编码植入酿酒酵母中，构建能同时利用木糖和葡萄糖的酵母基因系列。因此，在利用这些海滨植物原料进行产生物乙醇的试验仍然有待进一步的深入研究。