杀青工艺对蓝莓叶茶活性成分及其抗氧化性能的影响

闫 征，吴 寒，黄午阳，於 虹

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；2.江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京 210014)

蓝莓也被称为越橘，是近年来深受市场欢迎的特色小浆果，我国栽培蓝莓的历史不长，但近年来随着蓝莓果市场需求的扩大，其种植面积也不断增加[1-2]。蓝莓叶为全缘或有锯齿，是蓝莓产业的副产物，具有较高的食用和药用价值[3]。研究发现，蓝莓叶除含有粗蛋白等常规营养成分外，还含有多糖类、甾醇类、萜稀类、矿物质、氨基酸、维生素以及大量酚类物质，如绿原酸及其衍生物、咖啡酸、槲皮素、低聚原花青素等[4-9]。Ehlenfeldt等[10]测定了87种高丛蓝莓果实和叶子中多酚类物质的含量，结果发现虽然不同品种蓝莓叶和果中多酚含量存在显著差异，但蓝莓叶多酚平均含量为果实多酚的30倍左右。Turhan等[11]的研究不仅证实了蓝莓果多酚含量显著低于蓝莓叶，而且还证实蓝莓叶多酚的抗氧化活性以及清除自由基能力均显著强于蓝莓果。Naczk等[12]利用建立的β-胡萝卜素-亚油酸模型测定蓝霉叶多酚的抗氧化能力，结果发现蓝莓叶多酚的抗氧化能力和BHA相近，当蓝莓叶多酚添加量达到1 000 mg/kg时，脂质氧化的抑制率达到100% 。然而，在实际生产加工中，蓝莓叶却大多遭废弃，并未被有效开发利用。将蓝莓鲜叶加工成蓝莓叶茶可以发挥其抗氧化、抗病毒、减肥、降脂、预防心血管疾病的作用[13-16]。此外，蓝莓叶具有独特的香气，还是一种饮用品质极高的花草茶品种[17]。茶鲜叶通常需要通过热处理使其酶发生热变性，这在工艺上被称为“杀青”，杀青是茶加工中的重要工序。由于蓝莓叶中含有大量多酚氧化酶，如果不杀青会使蓝莓叶茶颜色变黄，丰富的多酚类活性成分遭到破坏，因此蓝莓叶茶的加工过程中杀青工艺对其品质形成以及化学成分的变化起到至关重要的作用[18]。鲜叶杀青的效果对后续工艺的影响很大，而且直接决定了产品的最终品质。茶鲜叶杀青的常用方法是炒青，蒸青、烘青、烫漂等方法也经常被使用，这些杀青方式均存在杀青时间较长、杀青不均匀等缺陷[19-22]。赵沙鸥等[23]对不同杀青方式夏秋茶的品质进行了比较，结果表明微波杀青绿茶在汤色、滋味、干茶外形方面均优于传统滚筒炒青工艺，且绿茶茶多酚、维生素、叶绿素等内在成分的含量更好地得到保持。周天山等[24]从理化性质和感官品质2个方面分析了多种杀青方式对绿茶品质的影响，结果表明微波杀青绿茶的干茶色泽也较好，且水浸出物、茶多酚、咖啡碱含量均高于其他几种方式处理。笔者将微波技术应用于蓝莓叶茶加工中，研究蒸汽杀青、微波杀青和炒青3种杀青方法对蓝莓叶茶活性组分及抗氧化活性的影响，分析几种常用杀青方法对蓝莓叶茶品质的影响，旨在为蓝莓叶的综合利用提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1材料与试剂蓝莓叶：于2017年8月从江苏省中国科学院植物研究所中山植物园采集，品种为兔眼。标准品没食子酸、芦丁、3-咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(HPLC纯度≥98%)，购自上海源叶生物科技有限公司；福林酚溶液、邻苯二胺溶液等购自南京寿德生物科技有限公司；甲醇和甲酸为色谱纯；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备FDU-1200型冷冻干燥机，为东京理化器械株式会社产品；HP706微波杀菌机，为南京策木微波科技有限公司产品；TriStar LB 941型微孔板式多功能分析仪，为德国Berthold Technologies公司产品；752S紫外可见分光光度计，为上海棱光技术有限公司产品；高效液相色谱-质谱联用仪Agilent 1100 HPLC /MS(SL)，为美国Agilent 公司产品。

1.3方法

1.3.1工艺流程。于2017年8月初采摘蓝莓树二次新生枝条上的鲜叶，叶尖为新生枝条芽尖及第1～3片嫩叶(一芽三叶)，鲜叶为新生枝条第4～7片成熟叶片。原料对照样品处理方法为将叶尖和鲜叶采集后直接冷冻干燥。样品的处理方法为将采集到的蓝莓叶尖和嫩叶当天制茶，采用以下工艺进行处理：原料选择→萎凋→杀青→揉捻→干燥→包装。其中萎凋时间为3 h，揉捻为手工揉捻，干燥为50 ℃热风干燥，最终产品水分低于4%。未杀青对照样品除不进行杀青外，其他处理方法与样品相同。

1.3.2杀青方法.①蒸青。投叶量为1 g/cm2，杀青时间3 min；②微波杀青。处理量为2 g/cm2，处理时间60 s，微波功率500 W；③炒青。投叶量为2 g/cm2，炒青时间3～5 min，温度约80 ℃。

1.3.3活性物质提取。用粉碎机将其粉碎，过40目筛，从上述工艺得到的蓝莓叶粉末中用分析天平分别称取1 g样品，分3次，每次用10、10、5 mL 85%的甲醇溶液在20 ℃条件下超声20 min，离心10 min，将上清液再经滤膜过滤，滤液即为蓝莓叶提取液，置于冰箱4 ℃下冷藏保存，待测。

1.3.4化学成分的测定。

1.3.4.1总酚含量(Folin-Ciocalteu)。取0.2 mL样品液，加入1 mL 0.5 g/L Folin-Ciocalteu试剂，充分振荡混匀后静置4 min，然后加入1 mL 75 g/L Na2CO3溶液，摇匀后在室温无光照条件下反应2 h，最后在波长760 nm处测定吸光值。总酚含量以每克样品中所含标品没食子酸当量(mg/g)表示。

1.3.4.2总黄酮含量(比色法)。取1 mL样品液，加入0.1 mL 5% NaNO2溶液，充分振荡后静置6 min，再加入0.1 mL 10% AlCl3·6H2O溶液，摇匀，静置5 min，然后加入1 mL 1 mol/L NaOH，振荡均匀后静置15 min，测定510 nm波长处的吸光度。黄酮含量用样品中所含标准品(芦丁)的当量(mg/g)来表示。

1.3.4.3原花青素含量(香草醛-盐酸法)。用纸将试管包裹严，直留试管口用于加样。向试管内加入0.5 mL样品液，然后加入3.0 mL 4%香草醛甲醇溶液，充分混匀，然后加入1.5 mL的浓盐酸，彻底混匀，室温下显色15 h。最后，在500 nm波长处测定其吸光度。样品的原花青素含量以每克茶样中所含标品儿茶素的当量(mg/g)表示。

1.3.4.4液质联用(HPLC-MS)分析。色谱条件如下：采用Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，自动进样器进样，进样量20 μL；流速为0.6 mL/min；柱温30 ℃，经流动相A为0.1%甲酸/水溶液，流动相B为甲醇。梯度设置如下：0～35 min，5%—80%流动相B；35～45 min，80%—5%流动相B。HPLC分离后导入液相色谱仪进行分析，采用 DAD 检测器，检测波长280 nm。质谱条件如下：雾化气N2，干燥气N2，毛细管温度为350 ℃，毛细管电压负离子模式下3.0 kV。质量扫描范围范围200～2 000 m/z。

标准品的配制：3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷作为标准品。准确称取上述4种对照品各0.010 0 g，用75%乙醇50 mL配制成单标对照品溶液，精密吸取单标对照品溶液适量配制成混标对照品溶液。

1.3.5体外抗氧化能力的测定。

1.3.5.1DPPH自由基清除能力的测定。用85 %甲醇液配置浓度为0.2 mmol/L DPPH·溶液，避光4 ℃保存，现用现配。将待测液稀释成不同浓度并分别取1 mL测定，以1 mL 85%甲醇液为空白，向试管中加入DPPH溶液1 mL，室温无光照条件下静置30 min，在波长517 nm下测定其吸光值。计算DPPH自由基清除率，公式如下：

(1)

式中，Ai为待测样品的吸光度；Aj为待测样品的本底值；A0为不加待测样品的对照值。

1.3.5.2羟自由基清除能力的测定。将1 mmol/L的硫酸亚铁溶液依次移入25 mL比色管中，再将3 mmol/L过氧化氢溶液分别移入，然后加入样品和空白对照，以蒸馏水为本底，最后加入3 mmol/L的水杨酸溶液并定容至刻度。37 ℃条件下水浴保温15 min，在510 nm波长处测定吸光度[19]。

1.3.5.3ABTS自由基清除能力的测定。分别称取0.038 4 g ABTS和0.013 4 g过硫酸钾，分别定容到10 mL，然后混合，避光12 h后，配成ABTS自由基储备液，使用前用85%甲醇液稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm波长下吸光度为(0.700±0.050)。取0.1 mL待测液，空白管加入0.1 mL 85%甲醇，最后加入3.9 mL ABTS工作液振荡30 s，室温下静置6 min后，在波长734 nm处测定吸光度。按照以下公式计算ABTS自由基清除率：

(2)

式中，Ai为加入待测样品的吸光度；Aj为待测样品的本底值；A0为不加待测样品的对照。

1.3.5.4氧化自由基吸收能力(ORAC)测定。在96孔微孔板上加入100 μL不同浓度的蓝莓叶提取液待测液，同时加入不同浓度 Trolox溶液作为对照，在每孔中同步加入50 μL 0.4 μmol/L荧光素钠混合后，在37 ℃条件下反应15 min，再向每孔中同步加入50 μL 60 mmol/L的偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)，立即用微孔板式多功能分析仪测定荧光强度(激发波长485 nm，吸收波长535 nm)，连续测定100 min。根据各微孔反应的荧光强度数据，采用积分法计算荧光衰退曲线下总面积(AUC)。

1.4数据处理所有数据均平行测量3次，结果以平均值±标准差表示。相关性与显著性使用GraphPad prism6.0软件和SPSS 20.0统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1杀青对蓝莓叶茶总酚含量的影响多酚类物质含量是构成蓝莓叶茶品质的关键指标，分别测定蓝莓叶尖和鲜叶原料以及经蒸汽杀青、微波杀青、炒青、未杀青样品中总酚含量，结果如图1所示。由图1可知，叶尖总酚含量明显高于鲜叶，未杀青叶尖和鲜叶样品与原料相比总酚含量分别减少了33.2%和66.4%，3种杀青工艺处理的蓝莓叶茶之间总酚含量存在明显差异(P<0.05)，其中微波杀青样品中检测到的总酚含量最高，与原料相比总酚含量分别减少了8.0%和15.0%，其次是蒸汽杀青，而传统炒青处理总酚含量最低。由此可见，微波杀青能在最大程度上保留蓝莓叶茶中的酚类物质含量。此外，蓝莓叶尖经炒青后总酚含量甚至低于未杀青对照组，这是由于蓝莓叶尖过于薄嫩，炒青温度过高极易造成叶尖中酚类物质被破坏而造成的。

图1 不同杀青方式对蓝莓叶茶总酚含量的影响 Fig.1 Effects of different blanching methods on the total phenolic content of tea from blueberry leaves

2.2杀青对蓝莓叶茶总黄酮含量的影响该试验测定了蓝莓叶尖和鲜叶原料以及经蒸汽杀青、微波杀青、炒青、未杀青样品中的总黄酮含量，结果如图2所示。从图2可以看出，无论经过何种杀青方式处理，叶尖总黄酮含量明显高于鲜叶，未杀青叶尖与原料相比其总酚含量损失超过50%，杀青明显减少了叶茶中黄酮类物质的损失。另外，微波杀青蓝莓叶茶的黄酮含量与原料无显著差异，蒸汽杀青使黄酮含量损失较多，炒青的处理效果最差，这与杀青对总酚含量的影响相一致。与叶尖相比，鲜叶茶总黄酮含量较原料变化总体不明显，其中蒸汽杀青对黄酮的保留效果最佳，这可能是由于鲜叶中酶种类和酶活力与叶尖差异较大所致。

2.3杀青对蓝莓叶茶原花青素含量的影响据报道，原花青素也是构成蓝莓叶中抗氧化活性物质的重要组成部分[25]。分别测定蓝莓叶尖和鲜叶原料以及经蒸汽杀青、微波杀青、炒青、未杀青样品中原花青素含量，结果如图3所示。由图3可知，鲜叶原花青素含量明显高于叶尖，这是由于原花青素是在蓝莓叶生长过程中逐渐聚合形成的，所以在新生叶尖中含量较低。通过比较3种杀青方式，叶尖中原花青素含量与原料相比变化较小，杀青样品中的原花青素含量显著高于不杀青对照样品。对于鲜叶而言，未杀青对照样品比原料中原花青素含量减少50%以上。这说明不同杀青方式均对原花青素有保护作用，明显减少了原花青素损失，其中微波杀青的效果最好，炒青效果次之，蒸汽杀青效果较差。

图2 不同杀青方式对蓝莓叶茶总黄酮含量的影响Fig.2 Effects of different blanching methods on the total flavonoid content of tea from blueberry leaves

图3 不同杀青方式对蓝莓叶茶原花青素含量的影响Fig.3 Effects of different blanching methods on the procyanidins content of tea from blueberry leaves

2.4酚类活性物质的组成分析蓝莓叶茶中酚类物质组成复杂，对蓝莓叶茶的活性成分进行HPLC-MS分析，结果见图3。根据相关文献报道[26]，并与标准样品进行比对可知，已检测并确定的物质有3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷，通过图谱分析发现蓝莓叶茶中还存在少量未知物质。由表1可知，绿原酸相对于其他酚类物质含量最高。异绿原酸在蓝莓叶尖中含量较高，但在蓝莓鲜叶中含量很低，说明蓝莓叶生长中异绿原酸发生了转化或转移。所有已测定的酚类物质在蓝莓叶尖中的含量均远高于蓝莓鲜叶，这与总酚和总黄酮含量的测定结果相一致，可见蓝莓新生叶尖是更好的制茶原料。不同杀青方法处理的蓝莓叶茶与鲜叶和未杀青对照组相比绿原酸含量存在显著差异，在不杀青直接进行干燥的情况下蓝莓叶尖和鲜叶的绿原酸降解分别达到52%和47%，这是由于干燥过程中蓝莓叶中丰富的多酚氧化酶造成大量绿原酸被氧化所致。杀青后，绿原酸含量得到了明显提高，尤其是微波杀青效果最好，为3%和6%，蒸青效果次之，传统的绿茶炒青工艺效果最差，蓝莓叶尖茶和鲜叶茶的绿原酸损失分别达到46%和23%。这主要在于以下2个方面原因：①微波杀青主要通过叶子内部受热，且受热温度较低，能够很好保留绿原酸等活性成分；②与茶叶相比，蓝莓叶较薄，质地更嫩，尤其叶尖极其鲜嫩，因此炒青时与高温炒锅直接接触极易导致叶子局部受热过度，绿原酸等酚类成分被降解，酚类物质严重损失。其他几种酚类成分在不同杀青条件下的保存情况与绿原酸相似，由此可见微波杀青工艺更适合于蓝莓叶茶的生产。

注：A为蓝莓芽尖的HPLC图；B为蓝莓鲜叶的HPLC图；C～F分别为HPLC图中主要成分3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷的MS谱图Note：A.HPLC profile of blueberry bud tip；B.HPLC profile of fresh leaves；C-F stand for MS profile of 3-caffeoyl quinic acid(chlorogenic acid)，3，5-dicaffeoylquinic acid(isochlorogenic acid)，quercetin-3-O-glucoside，kaempferol-3-O-glucoside图4 HPLC-MS分析蓝莓叶茶酚类物质Fig.4 HPLC-MS profile of phenolic compositions in tea from blueberry leaves

部位 Part杀青方式 Blanching methods3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)3-caffeoyl quinic acid(chlorogenic acid)3,5-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸)3,5-dicaffeoylquinic acid(isochlorogenic acid)槲皮素-3-O-葡萄糖苷Quercetin-3-O-glucoside山奈酚-3-O-葡萄糖苷Kaempferol-3-O-glucoside叶尖Leaf tip原料69.61±1.52 a8.94±0.42 a0.92±0.05 a0.54±0.02 a蒸青65.37±1.44 b6.90±0.38 b0.83±0.12 a0.46±0.05 b微波67.51±2.32 a7.77±0.73 bc0.89±0.07 a0.52±0.06 b炒青35.65±1.55 c4.84±0.41 d0.34±0.14 b0.40±0.02 bc未杀青33.38±1.86 c5.70±0.46 e0.69±0.12 d0.44±0.06 bc 鲜叶原料16.62±1.77 e0.31±0.15 f0.31±0.11 e0.26±0.07 dFresh leaves蒸青10.11±0.82 fg0.17±0.09 f0.16±0.02 f0.20±0.06 d微波15.62±1.79 e0.28±0.17 f0.18±0.04 fe0.35±0.07 d炒青12.78±1.78 f0.19±0.11 f0.17±0.05 fe0.28±0.06 d未杀青8.78±1.22 g0.15±0.06 f0.14±0.04 f0.26±0.04 d

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

Note：Different small letters indicate significant differences(P<0.05)

2.5不同杀青方式对蓝莓叶茶抗氧化能力的影响采用DPPH自由基清除率等4种评价化合物潜在抗氧化能力的常见方法测定样品的抗氧化活性，结果见表2。从表2可以看出，蓝莓叶尖及鲜叶3种杀青方式及鲜样和未杀青对照样品的DPPH自由基清除率从大到小依次为未杀青、炒青、原料、蒸青、微波和蒸青、原料、微波、炒青、未杀青；抑制羟自由基能力从高到低依次为原料、蒸青、微波、炒青、未杀青和原料、蒸青、微波和炒青、未杀青；ABTS自由基清除率从高到低依次为微波、原料、炒青、未杀青、蒸青、炒青、微波、原料、蒸青、未杀青；氧化自由基吸收能力从高到低为微波、原料、蒸青、炒青、未杀青和微波、蒸青、原料、未杀青、炒青。此变化趋势与总酚、总黄酮及绿原酸等含量变化不完全一致，这可能是由于不同杀青方式的蓝莓叶茶酚类等活性物质含量不同，且每种活性物质对抗氧化能力的贡献不同。微波杀青的蓝莓叶尖及鲜叶的ABTS自由基清除率和氧化自由基吸收能力均为最高，这与微波杀青的总酚、总黄酮及绿原酸等物质显著高于其他杀青方式的结果相一致(P<0.05)。

表2 不同杀青方式对蓝莓叶茶抗氧化能力的影响

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

Note：Different small letters indicate significant differences(P<0.05)

2.6相关性分析为了进一步研究不同杀青方法处理的蓝莓叶茶活性成分与抗氧化能力的关系，对不同杀青方法处理的蓝莓叶茶总酚、总黄酮、原花青素、绿原酸等物质含量及其抗氧化活性间进行相关性分析。由表3可知，总黄酮含量与氧化自由基吸收能力均呈极显著相关(R2> 0.80，P<0.01)，与ABTS自由基清除率呈显著中度相关(0.80>R2>0.50，P<0.05)；总酚含量与ABTS自由基清除率、氧化自由基吸收能力呈显著相关(0.80>R2>0.50，P<0.05)；对ABTS自由基清除率影响较大的酚类物质是3-咖啡酰奎宁酸即绿原酸(R2=0.686)、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(R2=0.688)；对氧化自由基吸收能力影响较大的酚类物质是3-咖啡酰奎宁酸(R2=0.843)。已测定的活性物质含量与 DPPH 抗氧化能力、抑制羟自由基能力的相关性不显著(P>0.05)。

注：*表示相关性达到显著水平(P<0.05)；**表示相关性达到极显著水平(P<0.01)

Note：* stands for significant correlation at 0.05 level；** stands for extremely significant correlation at 0.01 level

3 结论

由蓝莓叶尖制备的蓝莓叶茶除原花青素外，总酚、总黄酮及绿原酸等抗氧化成分显著高于鲜叶制备的蓝莓叶茶。不同杀青方式对蓝莓叶茶总酚、总黄酮等含量影响显著(P<0.05)，其中经微波杀青处理的蓝莓叶茶总酚、总黄酮含量最高，接近鲜样含量，其次为蒸青处理，传统炒青的样品中含量最低。经高效液相色谱分析发现，不同杀青方式处理后蓝莓叶中的绿原酸、槲皮素等成分均有显著性差异(P<0.05)，其中微波杀青蓝莓叶茶含量最高。体外抗氧化结果表明，微波杀青蓝莓叶茶的ABTS自由基清除率和氧化自由基吸收能力最高。相关性分析表明，蓝莓叶茶的抗氧化能力与总酚、总黄酮等物质含量有关。综上所述，由蓝莓叶尖制备的蓝莓叶茶功能成分含量优于鲜叶制备的蓝莓叶茶。经微波杀青处理的蓝莓叶总酚总黄酮等活性物质含量较高、抗氧化能力较强，优于其他2种杀青方法，较适用于蓝莓叶茶杀青。该研究可为今后进一步优化微波杀青工艺奠定基础，从而为蓝莓叶茶的工业化生产提供理论依据。