蜡状芽孢杆菌环糊精糖基转移酶的基因克隆表达·酶学特性及定点突变研究

花敬涵，杨静文，胡雪芹，张洪斌

(合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230009)

环糊精(cyclodextrins，CDs)是含有亲水外部和疏水中心腔的环状低聚糖，由于它们具有能够与许多难溶性亲脂性分子形成水溶性包合物的独特优势，故被广泛应用于制药、纺织、农业、化妆品、化学和食品工业等领域[1-3]。CDs通常由淀粉或淀粉衍生物经环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC 2.4.1.19)催化合成[4]。CGTase是α-淀粉酶家族的重要成员，是一种细胞胞外酶，可催化淀粉或多糖中α-1，4键裂解成CDs[5-6]。

CGTase的来源以细菌和古细菌居多，而真菌较少，这其中又以芽孢杆菌为主[3，7]。将CGTase基因在合适宿主中进行异源表达仍被认为是提高CGTase产量的有效方法，大约50%的商业化生产的CGTase是通过异源生产获得的[7-10]。在众多表达宿主中，大肠杆菌由于其低成本、易培养和高蛋白表达量，被认为是CGTase异源表达的最理想宿主[7，10]。VAN等[11]描述了环糊精糖基转移酶催化合成环糊精的具体机制。CGTase可以催化4种反应：环化、偶联、歧化和水解[12]。其中，环化反应(淀粉中α-糖苷键断裂，供体的一部分被分离出来作为受体环化产生CDs)是CGTase的特异性反应，产物多以 α-CD、β-CD、γ-CD这3种混合物的形式存在；偶联反应(CDs的环状结构中α-糖苷键裂解，所得的寡糖转移至受体底物形成糖基化产物)被认为是环化的逆反应；歧化反应(直链低聚糖的α-糖苷键断裂，产生的葡萄糖或低聚糖作为糖基供体转移到受体底物，生成聚合度不同的糖基化产物)和水解反应(水分子参与反应，催化底物分解成低聚糖)；环化、偶联和歧化反应均具有转糖基功能，其活性通常大于水解酶活[11，13-14]。

CGTase催化淀粉合成CDs，其产物主要是α-、β-和γ-CD的混合物(分别具有6、7和8个葡萄糖单元)，这给CDs的后续分离和纯化带来困难[3，7，15-16]。因此，提高催化产物的专一性对特定环糊精的实际生产具有重要意义，即产物特异性。近年来提高环糊精的产物特异性一直是研究热点，主要流行的2种有效策略包括向反应混合物中添加有机溶剂和使用定点突变来改变CGTase的结构[16-18]。尽管添加有机溶剂可以提高环糊精的特异性和总收率，但溶剂(例如甲苯或丙酮)的毒性和从最终产品中去除的成本限制了环糊精产品的大规模生产，特别是食品工业[18]。与添加有机溶剂作为复合剂相比，对CGTase进行分子改造的方法更环保且成本更低[16]。因此，理性改造CGTase以提高其产物特异性是必要的。

笔者对多种来源的CGTase基因进行序列比对，结果显示不同组的CGTase的残基31性质各不相同(图1)。而蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)来源的CGTase 中Ala47与环状芽孢杆菌(B.circulans)Ala31具有高度相似性。对蜡状芽孢杆菌来源的CGTase中Ala47进行了定点突变，并研究了47位氨基酸侧链对其环糊精产物特异性的影响，探讨此位点对CGTase产物特异性的影响，还分析了相关机制。

1 材料与方法

1.1菌种、材料与试剂将生物制药与酶工程实验室构建保存的重组质粒pBV220-cgt用作PCR反应的DNA模板，质粒pET-22b(上海生工生物工程公司)作为基因表达载体。限制性核酸内切酶(BamHI、SalI)、DNA聚合酶(FastPfu DNA Polymerase)、DNA连接酶(T4DNA Ligase)、Fast Mutagenesis System试剂盒、质粒提取试剂盒、用于表达的宿主菌E.coliBL21(DE3)和用于克隆的宿主菌E.coliDMT、E.coliDH5α均购自北京全式金公司。

α-CD、β-CD和γ-CD的标准样品购自上海生工生物工程公司(中国上海)，引物合成和DNA测序由苏州金唯智生物科技有限公司提供服务；其余试剂均为分析级。

1.2仪器与设备Life Eco PCR基因扩增仪购自杭州博日科技有限公司；Knauer高效液相色谱仪(包括示差检测器及色谱工作站)购自德国诺尔公司；TSKgel Amide-80 5 μm 色谱柱(250 mm×4.6 mm)购于东曹(上海)生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1β-CGTase基因的克隆。使用重组质粒pBV220-cgt作为模板，利用 Primer Premier软件设计引物，通过PCR扩增蜡状芽孢杆菌来源的β-CGTase的基因，其中设计的正向引物序列是5′-CGCGGATCCGATGATTACGCCAAGCTTTA-3′，反向引物序列是5′-ACGCGTCGACTTACCAATTTGATATGACC-3′，引物含有BamHI和SalI限制性位点(下划线)。具体扩增条件如下：94 ℃预变性3 min；接着进行30个循环(94 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃2 min)；最后72 ℃保温10 min。

随后用限制酶消化扩增的PCR片段，将PCR扩增产物与经BamHI、SalI双酶切的pET22b载体连接，得到重组质粒pET22b-cgt，随后通过热激法将重组质粒pET22b-cgt转化至E.coliDH5α。在经过涂布氨苄西林的固体LB抗性筛选后，挑选阳性克隆进行DNA测序，测序正确的E.coliDH5α即含有pET22b-cgt的克隆菌。

1.3.2重组β-CGTase的表达和纯化。从克隆菌中提取质粒，并转化到E.coliBL21(DE3)中，得含重组质粒的表达菌。将表达菌的菌株接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中(1%V/V接种量)，置于转速250 r/min、37 ℃下过夜培养；次日吸取适量种子培养菌液转接至新鲜LB培养基富集培养，在菌液浓度OD600达1.0时加入 IPTG并置于25 ℃下发酵诱导；在4 ℃、8 000 r/min下离心得到菌体沉淀，按照菌体干重加入对应量的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH为8.5)；随后振荡、超声破碎、离心，取上清液，即粗酶液。设计单因素试验，分别研究培养温度、菌浓(OD600)、IPTG剂量和诱导时间对β-CGTase表达量的影响。

通过硫酸铵沉淀和凝胶过滤技术对β-CGTase进行浓缩纯化。具体操作：使用质量分数为60%的硫酸铵对β-CGTase进行浓缩，缓慢且温和地搅拌混合物以有效促进盐析；待过夜盐析后，在4 ℃、8 000 r/min离心20 min，将沉淀重悬于10 mL 0.05 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.5)中；随后使用Sephadex G-100色谱柱(2.0 cm×80 cm)纯化β-CGTase，用甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.5)以20 mL/h的流速洗脱结合的β-CGTase。通过SDS-PAGE[19]测定β-CGTase的分子量。

1.3.3酶活力和蛋白含量的测定方法。酶活的测定采用碘值法[8]，具体方法为取10 μL适量稀释的酶液，加入0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)200 μL，加入200 μL质量浓度为0.2%的可溶性淀粉，在40 ℃、pH为8.5的甘氨酸-NaOH体系中反应10 min后，加入0.5 mol/L的冰乙酸500 μL终止反应。通过加入3 mL质量浓度为0.005%的碘液进行显色，同时以不加酶液的等量蒸馏水作为对照，根据700 nm波长下的吸光度(OD700)确定酶活，一个酶活单位定义为使吸光度下降10%的酶量[20]。

以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线，根据标准曲线测定蛋白含量，整个过程通过Bradford法完成[21-22]。

1.3.4酶学性质研究。以下关于β-CGTase酶学性质几项指标的测定均采用碘值法，并将在温度为55 ℃、pH为8.5下测定的酶活数值记为100%，以此计算相对酶活、剩余酶活。

1.3.4.1β-CGTase的最适温度。将β-CGTase在40～100 ℃范围内不同温度下孵育10 min后，测定各温度下的剩余相对酶活，确定β-CGTase的最适温度。

1.3.4.2β-CGTase的最适pH。在最适的pH条件下，酶的活性最高。分别用以下各缓冲液替换0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)，采用碘值法测定酶活以确定β-CGTase的最适pH：0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH4.0～6.0)、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0～8.0)、0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0～11.0)。

1.3.4.3β-CGTase的温度稳定性。将0.01 mL酶与0.2 mL 0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)在不同温度(40～90 ℃)下孵育30 min后计算剩余酶活以测定β-CGTase的温度稳定性。

1.3.4.4β-CGTase的pH稳定性。将0.01 mL纯化的酶分别在以下缓冲液中孵育30 min后测定剩余酶活以判断β-CGTase的pH稳定性：0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0～6.0)、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0～8.0)、0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0～11.0)。

1.3.5酶法合成环糊精及HPLC检测。将可溶性淀粉溶于甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)中，并在不断搅拌下煮沸至淀粉糊化，制备0.3 mol/L糊化淀粉。待糊化淀粉溶液冷却至室温，按照800 U/g淀粉的加酶量加入酶液。反应液经煮沸、离心及过滤后，通过HPLC检测并结合内标法计算可知CDs的生成量。

高效液相色谱(HPLC)检测条件：液相检测器为示差检测器，流动相为65%乙腈/35%水，流速为1.0 mL/min，色谱柱为X-Amide色谱柱，柱温为25 ℃。

1.3.6突变菌株的构建。以重组表达质粒pET22b-cgt为模板，引入各突变酶的设计引物(表1)，分别将47位的丙氨酸突变为丝氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、精氨酸，得到单突变体A47S、A47M、A47Y、A47R。各突变体的PCR反应程序均为94 ℃预变性3 min；接着进行30个循环(94 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃4 min)；最后72 ℃保温10 min。各突变体的PCR反应体系(50 μL)均为质粒pET22b-cgt1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，2×TransStart FastPfu PCR Supermix 25 μL，ddH2O 22 μL。

表1 突变酶的引物设计

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证其大小无误后，向PCR产物中加1 μL DMT酶，混匀，37 ℃孵育1 h，去除甲基化模板。然后将得到的酶切产物纯化，转化到E.coliDMT感受态细胞内，经过含氨苄青霉素的LB平板筛选，挑选阳性克隆并提取质粒进行测序。将测序结果正确的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，即得突变菌株的表达菌。

2 结果与分析

2.1蜡状芽孢杆菌β-CGTase的克隆与序列分析来源于蜡状芽孢杆菌的β-CGTase(GenBank：KF269705.1)的基因(2 085 bp)被克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。限制性分析表明大约2 100 bp的PCR片段(图1)被插入到pET22b载体中，得到重组质粒pET22b-cgt，其结构见图2。核苷酸序列测序结果表明，β-CGTase基因为2 085 bp，编码694个氨基酸残基，其核苷酸序列以登录号KF269705保存在GenBank数据库中。

注：1.经BamHI和SalI酶切得到的片段；M.DL8000 DNA MarkerNote：1.The fragment obtained by BamHI and SalI enzyme digestion；M.DL8000 DNA Marker图1 重组质粒电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of recombinant plasmid

图2 重组质粒pET22b-cgtFig.2 pET22b-cgt recombinant plasmid

2.2重组β-CGTase的表达图3A表明重组β-CGTase的最佳表达温度为25 ℃，培养温度对重组β-CGTase工程菌的表达有明显影响，这是因为在高温下，酶的表达速率太快而不能被正确折叠，因此形成了无活性的包涵体；而较低的培养温度可以减少包涵体的产生以产生更高的活性。由图3B可知，诱导的最佳菌体浓度是OD600为1.8对应的菌浓。当IPTG浓度为0.2 mmol/L时，诱导时间为16 h，CGTase显示出高酶活，因为高浓度的IPTG可以抑制细菌的生长(图3C、3D)。

2.3β-CGTase的纯化及酶学性质通过硫酸铵沉淀成功纯化β-CGTase，然后进行Sephadex G-100柱层析。纯化的β-CGTase在SDS-PAGE上显示出分子量为68 kD的单个条带(图4)，说明该酶在大肠杆菌中成功获得表达。在最佳发酵条件下，粗酶的比酶活可达5 239 U/mL。而经过Sephadex G-100柱洗脱可得到纯化酶，其比酶活是粗酶的10.68倍，纯化产率为30.91%(表2)。

由图5A、5B可知，该酶的最适温度为55 ℃、最佳pH为8.5。其酶活在pH为7.0～9.0时相对稳定(图5B、5D)，表明蜡状芽孢杆菌来源β-CGTase的催化条件适宜弱碱性，与文献报道CGTase的最适pH(5.0～8.0)结果一致[23]。图5C表明，当温度升至70 ℃时，酶仍表现出较高的活性，这有利于其催化淀粉合成CDs。因为淀粉结构中包含无定形区和结晶区，前者通常以松散结构呈现，容易被外界因素影响；后者大多由双螺旋结构形成，相对致密，不易被破坏，同时也难以被β-CGTase作用[24]。而随着温度的升高，淀粉的溶解度显著增加并且其晶体结构被破坏，这有利于提高β-CGTase的催化效率从而改善环糊精的产率[24-25]。

2.4影响环糊精生成的因素

2.4.1温度对β-CD产率的影响。在酶的催化反应中，温度对产物生成起重要作用。在pH 8.5和不同温度(40～70 ℃)下，向0.3 mol/L糊化淀粉溶液中加入800 U/g淀粉的β-CGTase进行反应。由图6可知，温度以2种方式影响β-CGTase酶促反应的速率。首先，升高温度(40～55 ℃)会增加底物分子的热能并提高反应速率，从而提高β-CD的产率(16.43%→28.49%)。然而，较高的温度(>55 ℃)会产生第2种效应，即增加β-CGTase蛋白结构的分子热能，这会使非共价键(例如氢键和范德华力)被削弱，而这些作用力维持β-CGTase的三维结构，这样就导致β-CGTase蛋白结构的解折叠，从而使β-CD产率降低(28.49%→13.23%)。由图6可知，最适合β-CD生产的温度为55 ℃，此时β-CD产率最高，这也与相似来源CGTase的最佳催化温度接近，即环状芽孢杆菌 E192来源的β-CGTase最佳温度为60 ℃[26]；Qiu等[27]使用来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的CGTase，在55 ℃时γ-CD的最大产率为32.9%；来自克拉氏芽孢杆菌(B.clarkii)7364的CGTase在55 ℃时其CD产率达到最大值45.3%[28]。

注：A.培养温度对β-CGTase酶活力的影响；B.OD600对β-CGTase酶活力的影响；C.IPTG浓度对β-CGTase酶活力的影响；D.诱导时间对β-CGTase酶活力的影响Note：A.effect of culture temperature on activity of β-CGTase；B.effect of OD600 on activity of β-CGTase；C.effect of IPTG concentration on activity of β-CGTase；D.effect of induction time on activity of β-CGTase图3 β-CGTase表达及发酵条件的优化Fig.3 Fermentation optimization research on expression of recombinant β-CGTase

注：M.蛋白质Marker；1.粗酶β-CGTase；2.硫酸铵沉淀后的酶β-CGTase；3.纯化后的β-CGTaseNote：M.Protein Marker；1.crude enzyme β-CGTase；2.enzyme after ammonium sulfate precipitation；3.purified CGTase图4 大肠杆菌BL21(DE3)β-CGTase的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant β-CGTase from the E.coli BL21(DE3)

种类Type总酶活Total enzyme activityU总蛋白量Total protein contentmg比酶活Specific enzyme activityU/mg纯化倍数Purificationfold剩余酶活Residual enzyme activity∥%粗酶Crude enzyme60 33011.405 292.1 — —60%(NH4)2SO441 132 4.808 569.21.6268.18SephadexG-10018 6480.3356 509.110.6830.91

2.4.2pH对β-CD产率的影响。在不同pH(6.0～10.0)和温度55 ℃下，将800 U/g酶粗溶液与0.3 mol/L可溶性淀粉一起反应。由图7可知，当pH为8.5时，β-CD的产率最高。最佳pH(8.0-9.0)的轻微偏差导致β-CGTase活性位点的电离发生变化，β-CD的产率略有下降(28.27%→25.94%和28.27%→26.47%)；当pH变化很大(> pH 10.0和

注：A.温度对β-CGTase酶活力的影响；B.pH对β-CGTase酶活力的影响；C.温度对β-CGTase酶稳定性的影响；D.pH对β-CGTase酶稳定性的影响Note：A.effect of temperature on activity of β-CGTase；B.effect of pH on activity of β-CGTase；C.effect of temperature on stability of β-CGTase；D.effect of pH on stability of β-CGTase图5 重组β-CGTase的酶学性质Fig.5 Properties of recombinant β-CGTase

图6 温度对β-CD产率的影响 Fig.6 Effect of temperature on yield of β-CGTase

图7 pH对β-CD产率的影响 Fig.7 Effect of pH on yield of β-CD

2.5突变酶的构建由图8可知，各组在8 000 bp左右处有条带产生，大小与目的条带基本吻合。

注：1.Wild；2.A47M；4.A47S；5.A47Y；6.A47R；3.DL8000 DNA Marker图8 各突变酶的PCR扩增条带Fig.8 PCR amplification band of each mutant enzyme

突变酶阳性克隆的测序结果见图9。由图9多重序列比对可知，各突变酶第47位氨基酸位点对应的碱基序列由GCG(丙氨酸的密码子)突变为CGT(精氨酸的密码子)、ATG(蛋氨酸的密码子)、AGC(丝氨酸的密码子)、TAT(酪氨酸的密码子)，表明突变酶A47R 、A47M、A47S、A47Y构建成功。

2.6定点突变对β-CGTase酶活力的影响采用碘值法测定各种酶的酶活，与原始酶相比，突变酶A47M、A47S的酶活有了不同程度的降低，而A47Y和A47R的酶活变化较小(表3)。几种突变酶的酶活数值比较可观，可用于环糊精的制备反应。

图9 β-CGTase在47位氨基酸位点突变的序列比对Fig.9 Multiple sequence alignment of the region around the residue 47 in β-CGTase

2.7定点突变对CDs产量的影响用原始酶Wild和突变酶A47S、A47M、A47Y、A47R按照“1.3.6”所述方法制备及检测反应液，β-CD、γ-CD的生成量及产物特异性(β-CD/γ-CD)变化不一(表4)。而突变后的氨基酸变为亲水性氨基酸(Ser、Arg)时，β-CD、γ-CD产量都明显增加，而且β-CD/γ-CD比值增大，表示亲水性氨基酸更利于CDs合成，其中对β-CD的影响更明显。而突变后的氨基酸变为疏水性氨基酸(Tyr、Met)时，A47M催化合成的CDs生成量减少，且β-CD/γ-CD比值也下降，说明疏水性氨基酸对β-CD产量的影响更大；而A47Y由于突变后氨基酸(Tyr)的疏水性低于Ala的疏水性，故β-CD、γ-CD合成量均比原始酶的多，这也与文献得到的结论相似[16]。

表3原始酶和突变酶的酶活比较

Table3Comparisonofenzymeactivityofwild-typeandmutantβ-CGTase

酶种类Types of enzyme比酶活Specific enzyme activity∥U/mLOD700Wild 5 2390.018A47M4 7680.020A47S4 6210.023A47Y5 3210.016A47R5 5480.013

表4原始酶和突变酶作用于淀粉的CDs产量比较

Table4ComparisonoftheyieldofCDswithwild-typeandmutantβ-CGTase

酶种类Types of enzymeβ-CDmg/mLγ-CDmg/mLβ-CD/γ-CDWild 14.124.732.99A47Y15.406.282.45A47M13.424.662.88A47S16.364.173.92A47R17.665.153.43

3 结论

来自蜡状芽孢杆菌的β-CGTase被克隆并在大肠杆菌中异源表达。在最佳诱导条件下，β-CGTase的比活力达5 292 U/mL。β-CGTase的分子量约为68 kD，最适温度和pH分别为55 ℃和8.5。通过控制pH、反应温度、反应时间，β-CD产量可达14.12 mg/mL且高特异性(产物中β∶γ=74.75%∶25.04%)。通过序列对比选取了第47位氨基酸(Ala)进行定点突变，构建了A47R、A47M、A47S、A47Y，发现活性区域中第47位氨基酸对产物特异性具有一定的影响，其中亲水性氨基酸更利于CDs(尤其β-CD)的合成，这为酶法合成β-CD的工业应用提供了方法。