槟榔中槟榔碱含量的不确定度评定

袁 河，肖晓义，康志娇，夏延斌，赵志友，江日初

（1.湖南省槟榔加工与食用安全工程技术研究中心，湖南宾之郎食品科技有限公司，湖南湘潭 411100；2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128；3.湘潭市食品药品监督管理局，湖南湘潭 411100）

槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechuL.）的干燥成熟种子，广泛栽培于中国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡、菲律宾等南亚及东南亚国家[1]。槟榔是四大南药之首，药理研究表明槟榔具有驱虫灭螺、抑菌、促胃肠道消化运动、诱发口腔黏膜纤维化病变和心血管病变等生理效应[2-3]。引起这种生理效应的关键物质就是槟榔碱[4-5]，它是槟榔的有效成分，也是槟榔化学物质成分中含量最多的生物碱，其含量达到0.30%～0.63%[6]。各种研究表明，只有当槟榔碱含量达到一定浓度以后才会产生各种生理效应，因此准确无误地测量槟榔中槟榔碱的含量对后续病理学研究具有十分重要的意义。

采用了高效液相色谱法测定槟榔中槟榔碱的含量，再依据JJF 1059.1—2012测量不确定度评定与表示，对测量海南原果中槟榔碱的过程中产生的不确定度进行了分析评定。充分验证了分析方法的可行性和合理性，同时确保了试验结果的准确性和有效性，为使用高效液相色谱法测定中药有效成分含量的不确定度研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

槟榔，海南新鲜原果。

氢溴酸槟榔碱标准品（纯度为99.8%），中国食品药品检定研究院提供；甲醇（色谱纯），美国TEDIA公司提供；磷酸、三乙胺（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司提供；十二烷基磺酸钠（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司提供。

1260 Infinity型配UV检测器，美国安捷伦产品；KQ-700E型超声波清洗机，昆山美美超声仪器有限公司产品；十万分之一分析天平、百分之一天平，奥豪斯仪器有限公司产品。

1.2 试样制备与测定

（1）将海南槟榔鲜果切开后放入干燥箱中于60℃下恒温干燥至恒质量，用粉碎机粉碎后，密封干燥备用。

（2） 准确称取槟榔试样1.0 g（精确到0.01 g），置于50 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL水，超声提取30 min，冷却至室温后，取上层清液用0.45μm滤膜过滤，滤液用于液相色谱仪分析。

1.3 标准溶液的配制

准确称取氢溴酸槟榔碱标准品13.89 mg于100 mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.138 9 mg/mL的氢溴酸槟榔碱标准储备液。

1.4 标准溶液工作曲线的绘制

准确移取0.138 9 mg/mL的氢溴酸槟榔碱标准储备液 1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中并加蒸馏水定容至刻度。得到标准溶液系列质量浓度分别为 13.9，27.8，55.6，83.3，111.1，138.9μg/mL。与样品溶液同时用高效液相色谱仪分析测定其峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，用最小二乘法拟合得标准曲线方程Y=a X+b（a为斜率，b为截距）与相关系数。

1.5 色谱条件

高效液相色谱条件为：色谱柱Hypersil BDSC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量10μL；检测波长215 nm；流动相：以水溶液（1 L水加入磷酸1.0 mL，十二烷基磺酸钠10 g，用三乙胺调节pH值至3） 为流动相A，以甲醇为流动相B。按流动相A∶流动相B=52∶48进行等度洗脱。

2 数学模型的建立

式中：X——试样中槟榔碱含量，g/kg；

C——由标准曲线得出的样液中待测组分的质量浓度，μg/mL；

V——试样提取液总体积，mL；

m——试样质量，g；

1 000——单位转换系数。

计算结果保留3位有效数字。

3 不确定度分量的主要来源

槟榔中槟榔碱含量测定的不确定度主要来自于标准储备液、标准曲线的拟合、样品的定容、样品称量、样品测量重复性及提取过程对样品回收率的影响。

4 不确定度的评估

4.1 标准储备液引入的相对标准不确定度u rel（c）

标准储备液引入的不确定度主要包括标准物质纯度、标准物质的称量及标准物质的定容。

4.1.1 标准物质纯度引入的不确定度u（p）

氢溴酸槟榔碱标准物质证书给出其纯度为p=99.8%，假设其为矩形分布，包含因子km=，则其相对标准不确定度为：

4.1.2 标准物质称量引入的不确定度u（m）

分析天平证书实际分度值d=0.01mg，区间半宽度αm=0.005 mg，假设其为矩形分布，包含因子km=，则其标准不确定度为：

称取氢溴酸槟榔碱标准物质的质量为13.89mg，则称量产生的相对标准不确定度为：

4.1.3 标准物质的定容引入的不确定度u（V）

（2）温度引入的不确定度。容量瓶的校准温度为20℃，实验室温度在20±5℃变化。液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因此只需考虑液体的体积膨胀。因此容量瓶溶液温度与校准时温度不同所引起的体积变化为100 mL×5℃×2.08×10-4℃-1=0.104 mL（2.08×10-4℃-1为水的膨胀系数），假设其为矩形分布，则温度对定容体积影响所引入的不确定度为：

因此定容体积引入的相对标准不确定度为：

由此得出标准储备液引入的相对标准不确定度为：

4.2 标准曲线的拟合引入的相对标准不确定度u rel（g）

标准曲线引入的不确定度包括定容容器和标准曲线的拟合。

4.2.1 配制标准溶液所用的容器引入的不确定度urel（b）

分别用2.0，5.0，10.0 mL分度移液管从标准溶液中分别准确移取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。

根据中华人民共和国国家计量检定规程JJG 196—2006，假设其为矩形分布。

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量器校准引入的不确定度见表1。

表1 量器校准引入的不确定度

因此容器引入的相对标准不确定度为：

4.2.2 标准曲线拟合引入的不确定度u（q）

试验对6个不同质量浓度标准工作液进行测定，记录所得峰面积与对应浓度。

标准曲线原始记录见表2。

表2 标准曲线原始记录

采用最小二乘法对氢溴酸槟榔碱的浓度与其对应的平均峰面积进行线性回归，得到氢溴酸槟榔碱标准曲线：Y=21.84X-3.34，R2=0.999 97。

对待测试样进行了6次测量，由标准曲线方程求得待测液中氢溴酸槟榔碱的质量浓度C氢溴酸槟榔碱，则C氢溴酸槟榔碱的标准不确定度为：

C氢溴酸槟榔碱的相对标准不确定度为：

由最小二乘法拟合曲线求得c氢溴酸槟榔碱时所产生的标准不确定度u（q）和相对标准不确定度urel（q）。

标准曲线不确定度结果见表3。

表3 标准曲线不确定度结果

由此得出标准曲线拟合引入的相对不确定度为：

4.3 样品定容引入的相对标准不确定度u rel（d）

（1）量筒引入的不确定度。由校准证书给出的100 mL量筒（A级） 的不确定度为0.2 mL，假设其为矩形分布，则100 mL量筒引入的不确定度为：

（2）温度引入的不确定度。量筒溶液温度与校准时温度不同所引起的体积变化为100 mL＞5℃×2.08×10-4℃-1=0.104 mL（2.08×10-4℃-1为水的膨胀系数），假设其为矩形分布，则温度对体积影响所引入的不确定度为：

因此样品定容引入的相对标准不确定度为：

4.4 样品称量引入的相对标准不确定度u rel（z）

称取槟榔样品1.00 g，校准证书给出分析天平允差为0.005 g，假设其为矩形分布，故由天平在样品称量时引入的不确定度为：

4.5 样品测量重复性引入的相对标准不确定度u rel（e）

分别称取6份同一槟榔样品1.00 g，测得样品中氢溴酸槟榔碱的含量，假设其为矩形分布。

样品6次平行测定结果见表4。

表4 样品6次平行测定结果

由表4得出，测量重复性引入的相对标准不确定度为：

4.6 提取过程对样品回收率的影响所引入的相对标准不确定度u rel（C Rec）

样品提取过程的回收率经对该样品所测的物质进行9次回收试验，得平均回收率为102.3%，其标准偏差4.21%。其标准不确定度采用平均标准偏差，其回收率的相对不确定度为：

提取过程回收率结果分析见表5。

表5 提取过程回收率结果分析

4.7 合成标准不确定度

上述各分量相对不确定度合成槟榔碱含量的相对标准不确定度为：

4.8 扩展不确定度

相对扩展不确定度在95%，置信水平下取包含因子k=2，得相对扩展不确定度为：

槟榔样品中槟榔碱含量为3.31g/kg，得扩展不确定度为：

综上可得，槟榔样品中槟榔碱含量不确定度为：3.31±0.052 g/kg（k=2）。

5 结论

槟榔中槟榔碱的测定的不确定度来源主要为标准储备液、标准曲线的拟合、样品的定容、样品称量、样品测量重复性及提取过程对样品回收率的影响。从不确定度的评定结果来看，标准曲线的拟合和样品测量重复性引入的不确定度最大，可以通过以下途径降低测定结果的不确定度：

①增强试验人员的技术能力，提高其操作稳定性；②多维护保养仪器，尽量提高仪器的精密度；③尽量保持试验温度的稳定性，减少随机误差。