钼蓝比色法测定特菜中还原型维C含量的研究

柳 青，刘继伟，黄广学，汪慧华，马长路，赵 婷

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442）

“特菜”指从国外和国内各地引进的名、特、优、新品种的蔬菜总称，通常具有“外形特、颜色特、营养特”三大特点[1]，富含人体必需的蛋白质、矿物质、有机物、膳食纤维和微量元素等，同时又具有一定特殊功能的蔬菜，是一种“药食同源”的功能性保健食品[2]。现今盛行的特菜品种有百利番茄、水果黄瓜、佛手瓜、美国苦苣、樱桃番茄、彩色甜椒、紫背天葵、羽衣甘兰、香芹、京水菜、乌塌菜等。特菜营养丰富、风味独特，其中还原型维C含量是果蔬主要的品质指标，是维持人体正常生理代谢必不可少的一类有机化合物[3]。食品中还原型维C的测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、2,6-二氯靛酚滴定法、荧光分析法（OPDA）等[4-6]。钼蓝法是指食品中的还原型维C将磷钼酸盐还原成蓝色络合物，通过比色的方法测出样品中还原型维C含量的一种方法[7]，它具有简便、快速、准确等优点，且不受蔬菜颜色的影响[8]。以冰菜、直立生菜、罗马生菜、芝麻菜、费菜、红橡生菜6种特菜为研究对象，对其维C的含量进行测定，以最大吸收峰、酸性介质、pH值、反应温度、反应时间等因素作为试验进一步研究的条件，以此确定钼蓝比色法测定食品中还原型维C的最佳试验条件，同时为特菜的产业发展提供理论参考。

测定原理：在酸性介质中偏磷酸和磷钼酸盐反应生成磷钼酸，并被还原型维C还原成的钼蓝化合物。化学反应如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜直立生菜、红橡生菜、罗马生菜、冰菜、芝麻菜、费菜，均采自北京市大兴区安定镇勤励园恒昌种植有限公司；普通生菜，市售。

1.2 仪器与设备

HR2095/30型搅拌榨汁机，飞利浦投资有限公司产品；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；FA1104N型电子分析天平。

1.3 试剂

①5%的钼酸铵溶液：准确称取钼酸铵25.000 0 g，加适量蒸馏水定容至500 mL容量瓶；②草酸-EDTA溶液：精确称取含结晶水的草酸6.300 0 g，EDTA 0.058 4 g，充分溶解定容至1 000 mL容量瓶；③5%的硫酸溶液：吸取5.00 mL的浓硫酸稀释至100 mL容量瓶；④偏磷酸-醋酸溶液：称取15.000 0 g片状偏磷酸于40 mL醋酸中，稀释至500 mL容量瓶，用滤纸过滤，取滤液备用；⑤标准维C溶液：准确称取抗坏血酸（维C） 0.100 0 g，用配好的草酸-EDTA溶液定容于100 mL容量瓶中，使标准溶液质量浓度达到1 mg/mL。

1.4 试验方法

1.4.1 标准曲线的绘制

分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL的抗坏血酸标准溶液及试样溶液，再加入草酸-EDTA溶液，使总体积达到10 mL；紧接着加入1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液，5%硫酸溶液2.00 mL和5%钼酸铵溶液4.00 mL，以蒸馏水定容于50 mL的容量瓶中，摇匀，静置15 min，以试剂空白为参照，于波长709 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.4.2 样品测定

准确称取红橡生菜、芝麻菜、冰菜、直立生菜、费菜、罗马生菜各50 g，分别加入适量草酸-EDTA溶液，经搅碎后转入100 mL容量瓶中定容、过滤。吸取上清液为待测的样品的提取液。

分别吸取各蔬菜的提取液10 mL于50 mL容量瓶中，加入1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液，5%硫酸溶液2.00 mL和5%钼酸铵溶液4.00 mL，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min，于波长709 nm处测定吸光度。

1.4.3 样品中还原型维C含量的计算

根据样液吸光度，计算各蔬菜样品中的还原型维C的含量：

式中：C——测定用样液中还原型维C的含量，mg；

V1——样液定容总体积，mL；

V2——测定用样液体积，mL；

W——样品重量，g。

1.5 数据分析

采用Origin软件制图，并用Spss软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 最大吸收峰的确定

维C在500～900 nm标准溶液的吸收曲线见图1。

图1 维C在500～900 nm标准溶液的吸收曲线

图1 表示在500～900 nm范围内维C标准溶液的吸收曲线，分别吸取0.2 mL（红），0.5 mL（绿），0.8 mL（墨绿），1.0 mL（紫） 的维C标准溶液，经15 min显色后在波长500～900 nm范围内扫描。结果表明，在709 nm处有最大吸收峰，因此试验选取709 nm为测定波长。

2.2 钼酸盐用量对吸光度的影响

钼酸盐用量对吸光度的影响见图2。

图2 钼酸盐用量对吸光度的影响

图2 为钼酸盐用量对吸光度影响的曲线，在酸性介质中，磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷杂多酸，便于进一步比色分析[9]。结果表明，随着钼酸盐用量的增加，吸光度增加，在4.00 mL左右达到最大值。因此选用5%钼酸铵溶液4.00 mL作为试验的反应条件。

2.3 酸性介质的选择

硫酸用量对吸光度的影响见图3。

图3 硫酸用量对吸光度的影响

由于维C具有较强的还原性，在空气中极易被氧化而变成黄色，尤其在碱性介质中更甚，测定时加入硫酸溶液使溶液呈弱酸性，以减少维C的副反应[10]。分别吸取0.5 mL的维C标准溶液，转入50 mL容量瓶中，加入适量草酸-EDTA溶液，使总体积达到10 mL，再分别加入5%硫酸1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 mL，于波长709 nm的条件下用1 mL的比色皿测定。由图3可知，硫酸用量在2.00～6.00 mL，有最大吸光度，因此选用l5%硫酸2.00 mL进行试验。

2.4 偏磷酸-醋酸用量对吸光度的影响

偏磷酸-醋酸用量对吸光度的影响见图4。

图4 偏磷酸-醋酸用量对吸光度的影响

偏磷酸和磷钼酸盐在酸性介质中生成磷钼酸，并被还原型维C还原成亮蓝色的钼蓝化合物[11]。由图4可知，随着偏磷酸-醋酸溶液用量的增加，吸光度的大小也发生相应的变化，变化趋势为先增大后趋于平稳最后缓慢下降，在用量达到1.00 mL后达到最大值并保持稳定，因此选用1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液作为试验进行的条件。

2.5 显色时间的选择

显色时间对吸光度的影响见图5。

由图5可知，该体系在草酸-EDTA溶液介质中于室温下反应15 min后达到稳定，满足测定时间的要求，因此选室温下的显色时间15 min进行测定。

2.6 标准曲线的绘制

于波长709 nm条件下维C的标准曲线见图6。

图6 于波长709 nm条件下维C的标准曲线

以维C标准溶液质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得出维C溶液质量浓度与吸光度之间呈现良好的线型关系，维C溶液质量浓度在0～1.4 mg/mL范围内服从比尔定律，标准曲线方程为A=0.392 2X-0.005 7，相关系数为R2=0.999 6。

2.7 特菜中维C的测定

通过试验，确定了钼蓝比色法测定蔬菜中还原型维C的最佳条件。在上述试验的测得条件下，测得6种特菜的维C含量，并以普通蔬菜为对照组进行显著性分析。

6种特菜中维C含量的比较分析见表1。

表1 6种特菜中维C含量的比较分析

由表1可知，普通生菜维C含量为12.15 mg/100 g，所测生菜的维C含量均高于普通生菜，直立生菜、红橡生菜、芝麻菜、冰菜、罗马生菜、费菜维C含量均与普通生菜存在显著性差异（p＜0.05），其中芝麻菜维C的含量最高，含量为95.62 mg/100 g；其次是罗马生菜和红橡生菜，维C含量分别为21.74 mg/100 g和21.29 mg/100 g，第三是直立生菜，维C含量为15.57 mg/100 g，费菜维C含量最低为13.71 mg/100 g。而在各种特菜维C含量差异的比较中，直立生菜、冰菜与费菜之间无显著性差异。

3 结论

采用钼蓝比色法测定特菜中还原型维C的含量，通过单因素试验确定了钼蓝比色法测定特菜的最佳反应条件为测定波长709 nm，偏磷酸-醋酸溶液1.00 mL，5%硫酸溶液2.00 mL，5%钼酸铵溶液4.00 mL，从而确立了一种简便、快速的测定还原型维C的方法。

利用钼蓝法对6种特菜中的维C进行比较分析，结果表明，直立生菜、红橡生菜、芝麻菜、冰菜、罗马生菜、费菜均与普通生菜维C含量存在显著性差异（p＜0.05），均高于市售普通生菜。其中，维C最高的为芝麻菜，含量为95.62 mg/100 g；其次是罗马生菜和红橡生菜，维C的含量分别为21.74 mg/100 g和21.29 mg/100 g，第三是直立生菜，维C的含量为15.57 mg/100 g。

维生素是人体生命活动所需的一种有机化合物，能够调节细胞的生长和体内正常的生命活动代谢，缺乏维C可导致坏血病，对细胞膜的氧化损伤起到修复作用，在体内起到抗氧化的作用[12]。通过新鲜食物摄入以满足人类日常生命活动的需求的维C是最健康的方式，试验中6种蔬菜所含的维C含量是普通生菜的1.1～7.8倍，在日常生活中可多吃特菜以补充人体中的维C[13]。