慢性阻塞性肺疾病动物模型的研究进展

叶荣琛 严国林 杨伊霖 蔡嘉威 钟臻蔚 朱莹莹 周玉民

1广州医科大学南山学院511436;2广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室510120

COPD 是一种常见的,可以预防和治疗的肺部疾病,其特点表现为持续的呼吸症状如咳嗽和呼吸困难以及气流受限,其发病与吸烟或生命早期不良接触史的协同作用以及有害颗粒或气体引起的气道和肺泡病变有关[1]。我国最新的大规模COPD 流行病学调查显示,我国COPD 患者人数约达一亿人,20岁及以上成人的COPD 患病率为8.6%,40 岁以上则达13.7%,60 岁以上人群患病率已超过27%[2]。COPD 发病受遗传因素和环境因素的双重影响,目前研究较多的发病机制包括慢性炎症反应、蛋白酶抗蛋白酶失衡、免疫反应失调、氧化应激和细胞凋亡等。作为临床前疾病机制研究的重要途径,建立COPD 疾病动物模型是COPD 各类研究工作的基础。近几年随着COPD 发病机制研究及进展的深入,出现了多种新的COPD 动物模型的构建方式,我们就当前COPD 动物模型的最新研究进展作一综述。

1 COPD造模动物的选择

目前已有许多实验动物被应用于COPD 动物模型的造模中,包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猪及其他灵长类动物等。对于实验动物的选择,实验者主要从解剖结构、病理变化、可行性及经济方面进行考虑。目前应用较多的为鼠类,常见的小鼠COPD 品系包括C57BL/6、BALB/c和A/J小鼠等,其优缺点如下。

小鼠COPD 模型具有以下优点：(1)已经具有明确的小鼠基因信息,且其与人类基因组接近,仅有约300个基因不同；(2)实验用抗体种类丰富； (3)小鼠品系繁多,且不同品系对烟草烟雾的反应存在差异,可供不同需要进行选择[3]；(4)易于制备转基因小鼠；(5)近交系小鼠的应用消除了遗传变异的问题；(6)小鼠繁殖周期短,数量多,实验费用相对较低。但小鼠也存在相应缺点： (1)小鼠呼吸系统和人类之间存在明显的生理学差异,如小鼠气道几乎没有黏膜下腺,导致其不能引起黏液高分泌的病理变化；(2)小鼠拥有不同于人类分叉状的单轴气道分支模式,其支气管分支数量与人类相比也大大减少[4]；(3)人与小鼠的免疫系统有较大的差别；(4)小鼠并不总是表达与人类相同的蛋白质。大鼠的优缺点与小鼠相似[5]。除鼠类以外,有些研究选用猪、羊或灵长类动物,这一类动物无论是在解剖结构亦或是病理变化上都与人类更为接近,但由于其饲养和实验成本高,且因涉及伦理问题而无法大批量进行实验,故应用范围较为局限。

2 常见造模方法及模型评价

2.1 气道吸入

2.1.1 香烟烟雾暴露 吸烟是目前COPD 最常见的病因,香烟烟雾暴露模型能复制多种COPD 病理生理改变,包括肺气肿样改变、气道慢性炎症、气道重塑、氧化应激、血管重塑及肺动脉高压等。Liu等[6]将雄性SD 大鼠全身暴露于香烟烟雾中,每次10支香烟,每天2次,持续4个月造模成功。然而全身暴露于香烟烟雾中可能使尼古丁等烟草有害物质通过动物皮肤黏膜或在动物整理皮毛时进入体内[7],因此单纯口鼻暴露于香烟烟雾较全身暴露更符合人类吸烟行为习惯。Shu等[8]通过比较全身暴露及口鼻暴露2种COPD 小鼠模型建立方法发现,仅采用口鼻暴露可以减少小鼠因皮肤烟雾残留出现的瘙痒、不适、战斗等行为,且在口鼻暴露模型中,小鼠的烟雾吸入量可以更准确地控制,实验结果更易重复。香烟烟雾暴露模型通过全身暴露或口鼻暴露模拟人类吸烟过程,可复制多种人类COPD 病理改变,是较为理想的模型。但香烟暴露模型一般造模时间较长,普遍在数个月至半年以上,造模过程耗费较多人力物力。香烟烟雾暴露患者在停止暴露后病理生理变化仍有进展加重,但动物模型停止香烟烟雾刺激后病理生理改变是否进展仍存在争议,需要进一步探究[9]。

2.1.2 可吸入颗粒物质 (particulate matter,PM)暴露PM 是空气污染中的主要成分,而PM2.5被认为在COPD的发病机制中具有关键作用。已有研究证明,随着PM 的直径减小,其穿透小气道并进入体循环的能力增强[10]。近年来,研究表明空气污染与COPD 的发病及疾病进展有密切关系[11]。最近的研究主要集中在两大空气污染源,即生物质燃料和机动车尾气[12]。He等[13]将64只雌性SD 大鼠分别暴露在生物质燃料、机动车尾气污染空气的PM 中,每天4次,每次1 h,每周5 d,持续7 个月,成功建造COPD 动物模型,其呼吸系统病理改变与人类COPD 患者病理变化一致,包括肺部炎症,肺气肿,小气道重塑,气道黏液分泌过多,肺功能减退和全身性炎症反应。而王光艳等[14]将Wistar大鼠暴露在浓度为500μg/m2的PM2.5中,为期3个月,同样成功构建大鼠肺气肿模型。污染空气PM 暴露的动物模型较好地模拟了暴露于污染空气的人类COPD 患者的过程及病理变化。但该模型制作时间较长,且目前PM 的制作过程繁琐,制作方式多样,难以控制PM 中各成分比例,也未能控制其他可能诱导COPD 的有害气体的浓度,如二氧化硫 (sulfur dioxide,SO2)、二氧化氮 (nitrogen dioxide,NO2)等。

2.1.3 其他有害气体暴露 除香烟烟雾及PM 以外,其他有害气体如SO2、NO2和臭氧等也可用于COPD 动物模型的构建。Wiegman等[15]将雄性C57BL/6小鼠暴露在O3中长达6周,成功制造COPD 小鼠模型。Wegmann等[16]将雄性C57BL/6小鼠暴露在吸入浓度为20 ppm 的NO2中,每天14 h,持续25 d,成功建造COPD 小鼠模型。Wagner等[17]将雄性SD 大鼠持续暴露在吸入浓度为20 ppm 的SO2中,持续25 d,成功建造COPD 大鼠模型,其病理改变符合COPD 样改变,此外还存在黏液分泌增多的特征性改变。

2.2 气管注射

2.2.1 气管滴注蛋白酶 蛋白酶-抗蛋白酶失衡学说是COPD 的重要发病机制,吸烟、氧化应激、有害气体或有毒物质可引起蛋白水解酶的增多或抗蛋白酶的不足。通过气管内滴注蛋白水解酶能复制出肺气肿模型,而常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以及人中性粒细胞弹性蛋白酶。Tibboel等[18]通过向C57BL/6 小鼠气管内滴注4.8单位/100 g的猪胰蛋白酶,成功造出肺气肿模型。毛旻等[19]通过向小型猪气管内注入6 单位/kg木瓜蛋白酶,每周1次,持续5周,成功诱导COPD。气管内滴注蛋白酶具有感染少、操作简便、注药剂量易掌握、造模时间短等优点。但酶的种类、剂量以及动物的品种、年龄对造模结果影响巨大,需要统一标准及严格控制。且此类动物模型容易诱导严重的肺气肿病变,但与人类常见的由于长期烟雾暴露慢性刺激引起的致病过程与病理变化不完全一致。

2.2.2 气管注射致病菌及菌液成分 除了气管内滴注弹性蛋白酶,也可通过注射致病菌或菌液成分诱导COPD。在气 道 中 病 菌 通 过 不 断 繁 殖 并 释 放 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖和多种酶刺激气道产生的慢性炎症反应,造成气道的损伤,从而实现其致病作用。许浒等[20]将Wistar大鼠注入肺炎克雷伯杆菌液0.1 ml,每周2次,持续2个月,成功制造具有COPD 病理学特征的动物模型。此外,气管内滴注LPS也可用于制作COPD 动物模型。LPS是革兰阴性菌细胞壁的成分,可以刺激单核细胞、中性粒细胞合成释放大量炎症因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-1β、破坏蛋白酶-抗蛋白酶平衡,介导呼吸系统炎症反应。Vernooy等[21]将雄性Swiss小鼠气管内滴注LPS,每次5μg,每周2次,持续12周,成功制作出COPD 小鼠模型。上述模型具有造模时间较短,操作方便等优点,且Sethi 和Murphy[22]的研究认为细菌感染可能是COPD 重要的致病因素,气管内注射细菌致COPD 动物模型模拟了这一发病过程。但其发病机制尚未完全清楚,此类COPD 动物模型可为后续研究提供方法学支持。

2.3 腹腔注射

2.3.1 腹腔注射香烟烟雾提取物 使用香烟烟雾提取物诱导COPD 动物模型也是一种常用的造模方法。Chen等[23]通过点燃香烟,将烟雾过滤去除颗粒物和细菌后装入含有PBS (1 ml/支)中制成CSE-PBS溶液,并使用6周龄雄性SD 大鼠,在第1、8、15天分别腹腔内注射1 ml CSE-PBS溶液,在3 周内成功诱导出肺气肿大鼠模型。CSE 诱导COPD 动物模型造模时间短,操作简单,病理生理变化与人类COPD 接近,但容易受到CSE溶液成分及实验动物的品种、年龄、给药方式和时间等因素的影响。腹腔注射CSE诱导COPD 的作用机制和途径尚不明确,可能使Th1细胞活化,炎症因子增多,进而导致蛋白酶-抗蛋白酶失衡,造成气道炎症反应及肺结构破坏,需要进一步的探究[24]。

2.3.2 腹腔注射内皮细胞及血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)受体阻断剂 近年来,研究发现细胞凋亡是重要的COPD 发病机制之一。刘绍坤等[25]报道在COPD 动物模型及患者身上发现肺泡上皮细胞凋亡指数及肺血管内皮细胞凋亡指数均升高且呈正相关,肺血管内皮细胞凋亡可引起肺泡间隔结构破坏消失,进而引起肺气肿。而成人肺中可产生大量的VEGF 蛋白,通过与其受体相结合而发挥促内皮细胞存活和抗凋亡的功能。Kasahara等[26]通过在雄性SD 大鼠皮下注射VEGF受体阻滞剂SU5416,直接导致肺毛细血管内皮凋亡,成功在3周后观察到大鼠肺泡间隔细胞凋亡,其病理改变符合肺气肿模型。Taraseviciene-Stewart等[27]将人脐静脉内皮细胞腹腔注射于免疫功能正常的SD 大鼠,3周后检测到内皮细胞抗体,且有肺泡间隔细胞凋亡等肺气肿样病理改变,成功建立自身免疫性肺气肿模型。细胞凋亡模型的特点在于肺组织中无明显炎细胞聚集等炎症表现,仅有肺泡腔扩大、血管重塑等变化,无明显气道病理改变,不完全符合COPD 患者病理变化,其作用机制仍待进一步明确。

2.4 基因工程技术 除上述传统COPD 动物模型,基因相关的肺气肿动物模型也是近年来的研究热点。部分研究使用了不同品系的基因突变小鼠,这些小鼠抗氧化能力及抗蛋白酶表达水平不同,且对烟雾的炎症反应也存在差异,因此对香烟烟雾暴露存在不同的反应[28]。基因工程小鼠也可通过基因敲除灭活VEGF基因,使肺部VEGF及VEGF受体2表达水平大幅下降,诱导出肺气肿样病理变化[29]。某些特定基因的组成性过度表达同样可以导致肺部异常发育,如IL-13和干扰素-γ的过度表达,可引起炎症反应及肺泡腔扩大等病理表现[30-31]。但基因的组成性表达会加速动物衰老,从而导致肺气肿的发生[32]。基因工程动物模型不符合人类COPD 患者的自然发病过程,不适合用于探究人类COPD 发病机制,且大量过表达的蛋白质也可能发挥与生理剂量不同的生理作用,在研究中需要考虑到这一点[28]。但此类模型可为进一步探究某些基因在COPD 发病过程中的作用提供支持。

2.5 多因素联合模型 人类COPD 患者的发病机制复杂,单一的造模方法难以模拟人类COPD 的病理变化和临床特征。建立标准化、符合临床实际的COPD 动物模型一直是国内外学者探索的难题,使用联合刺激方法构建COPD 动物模型不仅较好地还原人类COPD 的病理变化,且相比单一因素刺激更加节约时间和人力,同时也能在COPD 的基础上构建相关并发症或急性加重模型。余常辉等[33]通过对比单纯烟熏和烟熏联合气道内滴注LPS两种方法诱导原发性高血压大鼠慢性肺阻塞模型,观察到烟熏联合LPS组较单纯烟熏组表现出更明显的气道炎症、肺气肿及气道阻力增加,并且肺组织核因子κB信号通路激活、下游炎症瀑式反应及SP-A 减少都较明显,证实烟熏联合LPS组建立的高血压大鼠COPD 模型能更好的模拟人类慢性支气管炎及阻塞性肺气肿的形态学、功能学以及病理生理学改变。

3 模型评价

3.1 肺功能检测 肺功能检测对于研究动物呼吸生理功能的基本状况特别是判断是否出现气流受限具有重要的意义。有创肺功能检测主要具有敏感性和特异性高、可排除上气道阻力的影响等优点,但由于具有有创性与实验复杂性,其不能重复测量及实验耗时长的特点也较为显著。相比之下,无创方法具有对动物创伤小,因而允许在多个时间点重复测量且方法方便快捷的特点,故多用于需要重复测量且动物量较大的研究[34]。无创方法主要为体积描记法及强迫振荡肺功能技术[35]。常用的肺功能检测指标有呼气峰流速、潮气量、每分钟通气量、动态肺顺应性、吸气阻力、呼气阻力、气道阻力、用力呼气容积、用力肺活量以及两者的比值等。其中不同实验对FVC的测定时间的选择有所不同,常见的有0.05 s、0.1 s、0.2 s及0.3 s。

3.2 病理学检查 病理学检查通过将新鲜气道及肺实质组织置于固定液中进行固定,并进行石蜡包埋、切片,行HE 染色,于光学显微镜下观察,从而判断其病理变化是否符合COPD 样改变。用于评估气道病理改变的指标有：炎症细胞计数并通过半定量评分系统对其炎症程度进行分级；通过Masson 染色评估胶原沉积程度；通过AB-PAS染色检测黏多糖分泌情况；支气管壁厚度/直径以及平滑肌细胞横截面积等。而评估肺气肿病理改变的常用指标包括平均线性截距、肺泡平均截距、平均肺泡数量、肺泡比例以及肺泡破坏指数。

3.3 炎症细胞及介质检测 除上述肺功能及病理学检测外,支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血清中炎症细胞及炎症介质水平也可作为COPD动物模型判定标准之一。BALF 制取过程常通过对全麻动物模型进行气管插管,选择生理盐水或缓冲液,行单侧或双侧肺泡灌洗并留取BALF,BALF 常温离心后所得的细胞成分可用于细胞计数分析,所得上层清液可用于炎症介质等指标的测定。

3.4 其他指标 除了上述评价指标,氧化应激、蛋白酶及抗蛋白酶指标也可用于评价COPD 动物模型。在COPD 动物模型中常测的氧化应激指标包括丙二醛以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶和一氧化氮等[36]。其中丙二醛质量分数变化可反映肺受自由基攻击,脂质过氧化的程度。超氧化物歧化酶是需氧代谢细胞中的自由基清除剂,其活力可反映机体清除自由基的能力。由中性粒细胞产生的中性粒细胞弹性蛋白酶和巨噬细胞产生的基质蛋白金属酶 (matrix metalloproteinase,MMPs)、金属蛋白酶抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)、抗胰蛋白酶等为蛋白酶/抗蛋白酶中的主要成员[37],可通过免疫组织化学法来检测它们的表达。MMPs是降解气道细胞外基质成分的主要蛋白酶类,在研究中多以MMP-9 为重。已发现的TIMPs均由巨噬细胞和结缔组织细胞产生,其为MMPs特异的组织抑制因子,两者的动态平衡对维持细胞外基质和呼吸道结构的稳定有重要的意义,其中以研究TIMP-1多见。

4 总结与展望

人类COPD 具有复杂的病因及发病机制,目前尚无一种COPD 动物模型可以完全模拟人类COPD 所有特征,大部分动物模型主要模拟其中一种发病机制。烟草烟雾暴露模型可模拟相对较复杂的病理改变,且较好地模拟了人类COPD的致病过程,是目前最常见且较为理想的动物模型。近年来,随着COPD 流行病学相关研究发现除香烟烟雾以外,生物质燃料及机动车尾气相关污染空气也是COPD 重要致病因素之一。因此,使用污染空气PM 构建COPD 动物模型成为一种可行的新兴建模方法。随着COPD 动物模型的发展,将会出现能更好地模拟人类COPD 致病机制及病理生理改变的动物模型,使我们对COPD 的病因及疾病发展过程有更深入的理解。

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