微小RNA参与Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化疾病中的研究进展*

田平平， 石明隽**

(1.贵州医科大学 病理生理学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

肾脏纤维化(renal fibrosis)是各种原因引起的慢性肾脏疾病(chronic kidney diseases，CKD)进行性发展的共同病理结果，也是导致终末期肾衰竭(end-stage renal disease，ESRD)的关键原因。这一过程的特征性病理变化为肾小球硬化和肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)。肾脏纤维化的发病机制复杂，早期诊断较为困难，目前尚无有效的治疗方法。大量文献报道Wnt/β-catenin 信号通路在肾脏纤维化疾病的发生发展中发挥着重要的作用[1-3]；近年，有研究证明微小RNA(microRNA，miRNA) 参与了肾脏纤维化疾病的发生发展[4-6]。本文就miRNA调控经典Wnt/β-catenin 信号通路对肾脏纤维化疾病的影响进行总结，为以后肾脏纤维化及其防治研究提供参考。

1 miRNA

1993年，Lee等[7]从秀丽隐形杆线虫(caenorhabditiselegans)体内发现的一种对其生长发育至关重要的新基因lin4,其与lin-14 mRNA的3′非编码区(3′untranslated regions,3′UTR)有重复的互补序列，也是首次发现的miRNA。

miRNA是一类由内源基因编码的长度为19～25个核苷酸的非编码单链RNA 分子，miRNA来源于细胞内基因组编码的RNA前体(pri-miRNA)，pri-miRNA于细胞质中在Dicer酶的作用下形成成熟的miRNA，主要通过两种方式调控基因的表达：(1)成熟的miRNA与Dicer、Argonaute(AGO)等相关蛋白结合后形成一种RNA诱导基因沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，RIS能与mRNA 3′UTR区的靶序列特异性结合，若两者序列完全互补，则切割靶mRNA，若两者序列不完全互补，则抑制靶蛋白的翻译；(2)miRNA在哺乳动物中高度保守，调节相当数量的基因并参与一些关键的生命过程，miRNA的失调可能导致细胞功能受损，并且与多种疾病的发生发展有关。越来越多的证据表明，在真核生物中miRNA的调控作用涉及个体发育、细胞分化、增殖、代谢、凋亡和肿瘤等[8-10]。近年来研究也证实miRNA在肾脏疾病的发生发展中起着重要作用[5-6]。

2 Wnt信号通路

目前，在哺乳动物体内证实有20种Wnt基因存在，其编码的Wnt蛋白是动物进化过程中十分保守的分泌型糖蛋白，调控着Wnt信号通路[11]。Wnt信号通路是生物体发育发展的一个重要信号通路，其内在多级调节已得到大量研究及广泛认可。在正常生理状态下，Wnt信号通路按程序有序的激活与静止，参与胚胎发育和组织发展过程中细胞增殖、分化以及凋亡的过程[8-9]。Wnt信号通路分为经典的Wnt/β-catenin信号通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)和非经典的平面细胞极性通路(planar cell polarity pathway)、Wnt/Ca2+通路等。

2.1 经典Wnt信号通路

经典Wnt信号通路的成员主要包括：细胞外因子(Wnt)、跨膜受体(frizzled，Frz)、Wnt共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LDL-receptor-related protein,LRP5/6)、散乱蛋白(dishevelled,Dsh或Dvl)、轴蛋白(Axin)、肿瘤基因抑制物大肠瘤样息肉蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)、β-连环蛋白(β-catenin)及核内转录因子淋巴样增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)等一系列蛋白；其中Frz蛋白是一种7次跨膜蛋白，具有高度保守富含半胱氨酸结构域(cystein rich domain,CRD)，Frz在胞外端的CRD区能够与Wnt配体结合。当缺乏Wnt信号因子时，胞质内的β-catenin 与CK1、GSK3β、APC及Axin形成降解复合物，而CK1和GSK3β可以使胞质内的β-catenin 蛋白磷酸化(常见磷酸化位点33、37位丝氨酸以及41位色氨酸)，磷酸化的β-catenin 可被E3泛素化连接酶复合体上的亚基Fbox/WD重复蛋白( β-Trcp)识别而泛素化后被蛋白酶体降解，故β-catenin 在胞浆中保持较低水平无法进入细胞核，从而限制Wnt信号通路下游靶基因的表达；当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt蛋白与Frz和LRP5/6受体结合，此时Frz的胞内端会与作用于β-catenin和GSK3β上游的Dvl结合并使其磷酸化[12]；随后DVL多聚化并诱导LRP-Wnt信号小体的形成，Dvl反过来募集Axin以及Gsk3β使β-catenin降解复合物解体，此时β-catenin不能降解进而在胞浆中积累后入核，与 LEF/TCF结合激活Wnt靶基因转录，包括纤维化相关基因如纤连蛋白(Fibronectin，FN)、基质金属蛋白酶7(matrix metallo proteinases-7，MMP-7)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、Twist 及Snail等，活化Wnt信号通路，调控细胞的生长，分化，影响组织细胞的功能。

2.2 非经典Wnt信号通路

非经典的Wnt信号通路是一种不依赖β-catenin的传导方式，包括平面细胞极性通路(planar cell polarity pathway)，即Wnt /PCP 通路、Wnt/Ca2+通路。在哺乳动物中Wnt /PCP 通路是一种高度保守的信号通路，主要参与调控细胞的骨架重排与基因的表达；Wnt/Ca2+通路主要通过激活磷脂酶C(PKC)和蛋白激酶C(PKC)调控细胞内Ca2+进而激活下游靶基因的表达，参与神经退行性变、炎症和癌症等过程[9]。

2.3 Wnt信号通路拮抗因子

根据结合部位不同，Wnt信号通路拮抗因子主要分为两种，一种可以与Wnt受体直接结合，如分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein family SFRPs)及Wnt抑制分子(Wnt inhibitory factors，WIFs)；另一种与Wnt共受体LRP5/6结合，包括Dickkopfs(DKKs)家族和Wise/SOST家族。

2.3.1SFRPs是一种调控Wnt信号通路的分泌性糖蛋白，也是第一个被发现的Wnt拮抗剂。SFRPs由大约300个氨基酸组成，结构上缺乏跨膜区，由信号序列、亲水的发夹结合域组成的C-端以及含有CRD结构的N-端组成。其有5个家族成员，包括SFRP1～5，因与Wnt信号通路中的特异性受体Frz在结构上具有同源的CRD区域，因此可与Frz竞争性结合Wnt配体而抑制经典或非经典Wnt信号通路[13]。研究证实，SFRPs参与调控细胞增殖、分化，在多种肿瘤组织中呈低表达状态[14-15]。所以，SFRPs被认为是一类肿瘤抑制因子。

2.3.2WIFs WIF1第一次被发现是在人类视网膜细胞中，WIF1在多种组织细胞中广泛表达，尤其是脑、视网膜、肺脏及软骨等组织中。WIF1是一种由379个氨基酸组成的蛋白质，具有高度保守的WIF1结构域、5个表皮生长因子(epidermal augmentum factor,EGF)重复序列及一个亲水性尾[13]。Hsieh在非洲爪蟾蜍胚胎中证实，功能与SFRPs相似，WIF1能够通过阻断Wnt与其受体结合，进而影响经典或非经典Wnt信号通路[16]。研究证实，在软骨发育过程中，WIF1可以与信号通路中Wnt蛋白结合(如Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt9a及Wnt11)调控Wnt活性[17]。但WIF1调控Wnt信号通路的具体机制仍不十分清楚，但与SFRPs一样，WIF1也参与了肿瘤的发生发展过程[18-20]。

2.3.3DKK在脊椎动物中，DKK家族由4个成员组成,即DKK1～4。它们由255～350个氨基酸组成且含有两个保守的CRD。在Wnt蛋白活化的多种信号通路中，DKK家族特异性的抑制Wnt/β-catenin信号通路。研究发现，DKK1、DKK 2及DKK 4可以与LRP6结合，调控Wnt信号通路，而DKK3不与LRP6结合，却可以调控TGF-β信号通路[21-22]。

2.3.4Wise Wise也被称为SOSTDC1、Ectodin或USAG-1。在非洲爪蟾中，Wise是Wnt信号的一个环境依赖性调节因子，它可以抑制或激活不同实验中的Wnt信号通路[13]。研究发现[23-24]，Wise和SOST可以抑制BMP信号通路,但具体病理生理机制仍不清楚。

3 肾脏纤维化

肾脏纤维化是多种CKD发展的最终结局，是肾小球、肾小管等在持续损伤情况下表现出的形态学结果。由于肾脏结构进行性破坏，导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化等，最终引起肾脏功能丧失。

3.1 肾小球硬化相关细胞

肾小球固有细胞包括足细胞、系膜细胞、内皮细胞，它们均能产生不同程度的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，如Ⅳ型胶原(col-Ⅳ)、纤连蛋白(Fibronectin，FN)、层黏蛋白等。正常情况下，它们行成基底膜构架，对维持正常肾小球结构、固定临近细胞和形成滤过屏障起主要作用。病理情况下，当ECM合成增加并不断积聚于系膜区，挤压毛细血管腔，造成肾小球细胞不断凋亡，使肾小球滤过功能逐渐减退。

3.2 肾小管间质纤维化相关细胞

肾小管间质纤维化涉及细胞众多，包括肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肥大细胞及各种炎细胞等。肾小管上皮细胞在急性肾损伤的情况下可改变细胞内信号转导和基因表达，如波形蛋白增多，Ⅰ型、Ⅲ型胶原增多，E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-ca)表达减少，引起肾脏纤维化，为间质纤维化提供关键的信号。肌成纤维细胞表达平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)，此细胞常与基底膜相连，产生大量的ECM。成纤维细胞是ECM的主要来源，在接触损伤的肾小管基底膜后，通过旁分泌信号传导可导致成纤维细胞获得肌成纤维细胞形态，引起Ⅲ型胶原的产生。

4 Wnt/β-catenin信号通路与肾脏纤维化

Wnt信号通路是一类广泛存在于真核生物中高度保守的信号通路，在生物体的发育发展起着重要作用，参与了细胞的增殖、分化以及凋亡的过程。越来越多的研究发现Wnt/β-catenin信号通路与肾脏纤维化疾病的发生发展密切相关[4-6]。

4.1 Wnt/β-catenin信号通路与肾小球硬化

足细胞是一种终末分化细胞，一旦损伤便不可以修复。足细胞内含有大量的血管微丝，构成肌动蛋白的细胞骨架，维持足细胞静态与动态结构；一旦肾小球受到损伤，足细胞会产生各种表型改变以及细胞脱失，进而引起毛细血管壁塌陷、系膜细胞的增生以及ECM的沉积，最终引起肾小球硬化。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路活化可以引起足细胞功能紊乱，促进蛋白尿的形成[25-26 ]。在体内过表达Wnt1可以激活肾小球中β-catenin的表达、加速蛋白尿的形成；而用Wnt信号通路拮抗基因DKK1阻断Wnt信号可以改善足细胞损伤。另外,在糖尿病肾病和局灶节段性肾小球硬化疾病中，观察到足细胞中Wnt1及β-catenin表达明显增多。Wang[5]发现在高糖培养的系膜细胞中，Wnt信号通路关键分子β-catenin表达明显增多，而用黄芪甲苷Ⅳ处理后，β-catenin表达显著减少。Lin[3]发现在CKD大鼠肾组织中，凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax蛋白表达明显增多，Bcl-2表达减少，Wnt信号通路关键分子β-catenin表达增多；而在体外系膜细胞发现β-catenin si-RNA可以明显抑制TNF-α诱导的细胞凋亡且抑制纤维化相关指标如FN、TGF-β、 collagen I、collagen III 及 collagen IV的表达。细胞在特定的环境下发生的形态、结构以及功能的改变成为表型转化或转分化、去分化。研究证实，在CKD中，即便系膜细胞损伤不是始动原因，仍可成为肾小球硬化的中心环节，在损伤因素刺激下，系膜细胞发生表型转变，引起系膜细胞增殖产生大量ECM，细胞因子合成增加，通过各种途径促进细胞增殖，ECM积聚，引起肾小球硬化，最终导致肾衰竭。

4.2 Wnt/β-catenin信号通路与肾小管间质纤维化

孔静等[27]研究发现Wnt4/β-catenin信号通路活化可以促进糖尿病肾病大鼠肾小管纤维化的发展。He[28]也发现Wnt拮抗基因DKK-1可以减少UUO小鼠肾脏中β-catenin的积累，抑制Wnt/β-catenin信号通路靶基因的表达，从而抑制col-Ⅰ、FN的表达，减少肾间质纤维化的发生。研究发现给CKD小鼠腹腔注射硫酸吲哚酚后，β-catenin表达水平明显增多，α-SMA以及胶原沉积更加明显，而Wnt/β-catenin信号通路拮抗因子SFRP5因发生DNA甲基化而表达显著下降[1]；利用DNA甲基转移酶药物5-Aza-cytidine或SFRP5重组蛋白处理硫酸吲哚酚腹腔注射过的CKD小鼠，结果发现β-catenin表达水平明显降低，α-SMA以及胶原沉积显著减少，提示SFRP5可以抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肾小管纤维化的发生。

5 miRNA参与Wnt/β-catenin信号通路调控与肾脏纤维化疾病的关系

近年来，miRNA引起了广泛关注，并被证实miRNA通过与mRNA 3′UTR结合，导致mRNA降解，进而参与多种肾脏纤维化疾病的发生。Wu[29]发现在高糖培养的肾小球系膜细胞和STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠肾组织中，miR-27a通过负性调控PPAR-γ的3′UTR区域促进ECM沉积，而miR-27a的反义寡核苷酸可以显著降低STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中miR-27a的表达，减少ECM和蛋白尿的沉积；同时在高糖培养的肾小球系膜细胞中转染miR-27a的抑制剂，发现系膜细胞的增值能力明显降低，提示miR-27a可以促进系膜细胞的增殖以及ECM的沉积。最近也有文献报道在高糖培养的足细胞中形成miR-27a/PPARγ/β-catenin通路，引起足细胞损伤，使得miRNA成为潜在的治疗DN的靶点[32]。上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition ，EMT)是上皮细胞经过多种生物化学改变获得间充质细胞表型的过程，也是肾脏纤维化发生的关键因素，目前发现EMT过程受miRNA调控，如miRNA-29b[30]，miRNA-27a[31]等。TGF-β是目前为止发现的最强的引起纤维化的因子， He[6]发现在TGF-β处理的HK-2细胞中，不仅有细胞表型发生EMT转变的现象，也发现miRNA-328的表达呈下降趋势，为了进一步研究miRNA-328对肾脏纤维化的发病机制，He在TGF-β诱导的HK-2细胞中再次转染miRNA-328 mimics，结果发现TGF-β,α-SMA ,Fibr,col-Ⅱ RNA和蛋白水平表达均有所下降，同时E-ca表达水平显著提高，即miR-328 mimics明显抑制了 TGF-β诱导的EMT的发生。Wang[5]发现在高糖培养的足细胞和系膜细胞中，miR-21表达增加，且有细胞表型的变化，且miR-21的过表达增加了active-β-catenin的表达水平，作者进一步应用Wnt抑制剂XAV-939刺激足细胞和系膜细胞，这一现象被逆转。Liu[33]研究发现，在HK2细胞中miR-21可以靶向调控DDAH1活化Wnt/β-catenin信号通路促进间质纤维化与细胞凋亡。Li[34]研究发现在缺血再灌注损伤的大鼠模型以及缺氧处理的大鼠肾小管上皮细胞中，miR-182表达明显增多，而且证实miR-182可以抑制TCF7L2的表达活化Wnt/β-catenin信号通路加速缺氧诱导的细胞凋亡。这些发现证实miRNA与Wnt信号通路之间的相互作用，并提供了一个miRNA-Wnt信号通路-细胞生理过程的调控机制，然而关于miRNA与Wnt信号通路在肾脏纤维化发病机制的研究仍需进一步的阐明。

6 问题与展望

目前，肾脏纤维化疾病仍是临床与基础研究的一大难题，Wnt/β-catenin通路功能异常在人类肾脏纤维化疾病中有显著的表现。目前的研究对于Wnt信号通路在肾脏纤维化疾病发生发展中的调控机制尚未彻底阐明，但也正是由于Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化疾病中的调控机制的复杂性使其为各种纤维化疾病提供许多潜在的治疗靶点。随着近年来对Wnt/β-catenin信号通路在肾脏纤维化疾病中的作用及该通路所受到的转录后调控机制的认识逐渐加深，使部分miRNA对Wnt/β-catenin信号通路的调控方式、调控机制以及对机体的影响得到进一步的了解，也为肾脏纤维化疾病的靶向治疗提供新的思路，进一步深入研究两者的调控机制及生物学功能对未来肾脏纤维化疾病的临床治疗有重要意义。