调控气道杯状细胞分化的抗小儿哮喘药物研究进展

龚文婷 万蒞

湖北省妇幼保健院药剂科,武汉430070

支气管哮喘(哮喘)是一种发病机制复杂的气道慢性炎症性疾病。近年来,其在幼儿群体中,发病率逐年升高,已引起极大的关注[1]。研究表明小儿哮喘涉及多种细胞,尤其与免疫细胞,气道上皮细胞等细胞之间的互动异常有关,其病理生理特性主要表现为气道高反应性(airway hyper-responsiveness,AHR)和气道黏液的异常高分泌[2]。气道黏液的正常分泌可维持气道屏障,维持气道上皮细胞功能正常方面发挥重要作用,但其异常分泌则可能导致哮喘患者气道阻塞,进而导致气流受限,引起哮喘患者病情加重,甚至引起死亡[3]。

调控哮喘状态下的气道黏液分泌,可能对哮喘的治疗具有重要意义,本文主要从与气道黏液分泌密切相关的气道上皮细胞分化调控角度[4],分析其可能干预环节,总结调控气道上皮细胞分化的潜在靶点及药物,以期为相关药物的开发提供思路[1,4]。

1 哮喘下的气道杯状细胞分化异常

1.1 气道杯状细胞的分化 人气道上皮是保护人体呼吸道免受外部刺激损伤的主要屏障。它主要由三种细胞组成：分别为基底细胞、纤毛细胞和分泌细胞(杯状细胞和棒状细胞)。其中杯状细胞与黏膜下腺体一起分泌MUC5AC 和MUC5B这两种黏蛋白,进而作为气道黏液的重要组成部分,维持气道的正常功能[5]。

气道杯状细胞的分化可导致气道杯状细胞数目增加,同时可上调黏蛋白,如MUC5AC和MUC5B的上调,进而使气道中黏液分泌增加,保护机体免受外界病毒、细菌对气道或肺部的感染[6]。但在某些慢性气道炎症状态下,其气道杯状细胞表现为异常分化,进而使黏蛋白异常分泌与积聚,并随着时间的推移增加感染概率及气道阻塞[4]。

1.2 哮喘与气道杯状细胞分化异常 在幼儿哮喘患者的气道中,可见平滑肌细胞增生、杯状细胞增生、黏膜下层腺体增生/肥大、上皮细胞纤维化等细胞异常病变。这种气道重塑可造成细胞的反复损伤,进而导致吸入更多的过敏原和环境刺激物、感染,进而诱导一系列炎症和免疫异常应答。其中气道杯状细胞分化异常是其中的一个重要病理学改变[4]。

幼儿哮喘患者体内,多见与气道黏液密切相关的黏蛋白的异常表达。在正常的气道黏液中,MUC5B 可以线性排列同时通过杯状细胞分泌的 MUC5AC 进行锚定[6],除这些黏蛋白外,还有盐、脂蛋白等,其中固体含量约为3%左右。而在哮喘患者的黏液中,其固体比例可达到15%[7]。而固体比例的增加将导致更多的分子间相互作用,并形成更厚、黏性更强的凝胶层。进而进一步的影响哮喘的疾病进程[4,8]。

2 与气道杯状细胞分化密切相关的信号通路

气道杯状细胞的分化调控与多种信号通路有关,且这些信号通路间还存在着交互调控,目前报道较多的主要有表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),Th2型细胞因子,Notch 通路,信号转导与转录激活因子6(signal transducers and activators of tranion 6,STAT6)信号通路以及Wnt信号通路[8]。

2.1 EGFR EGFR 是与生长密切相关的多功能受体蛋白,在哮喘模型小鼠的气道中,可见EGFR 免疫反应性与气道杯状细胞的分化增加呈正相关,提示EGFR 参与调控了气道杯状细胞的分化。EGFR 信号转导涉及四种细胞表面受体蛋白(EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4)。多种配体如表皮生长因子[6],转化生长因子α与ErbB受体二聚体结合,后续经历构象变化,导致激活多种下游蛋白质复合物,包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B,丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶等,进而调控气道稳态。转化生长因子α和表皮细胞生长因子可由多种炎症细胞,如嗜酸粒细胞和中性粒细胞分泌。而影响这些炎性细胞,则会使EGFR 信号转导异常,导致哮喘疾病状态下的气道黏液异常分泌[9]。

虽然EGFR 明显与气道杯状细胞分化有关,但靶向EGFR 的治疗方法仍面临巨大挑战。EGFR 酪氨酸激酶抑制剂BIBW 2948在临床试验中未能减少慢性肺阻塞患者气道黏液量及黏蛋白的表达。后续可重点关注EGFR 下游的信号通路,或通过调控相关信号通路的互动起到相应的治疗作用[10]。

2.2 Th2型细胞因子 除EGFR 信号通路外,许多细胞因子,如IL-13、IL-4、IL-5和IL-9等[11],有研究表明IL-13可以在许多物种的气道上皮细胞中诱导持续性的气道杯状细胞分化,这可能与IL-13激活EGFR 信号通路有关,而通过特异性抑制剂拮抗EGFR,可抵消IL-13 诱导的杯状细胞分化[12]。

此外IL-4和IL-5亦是黏液诱导剂,特别是在哮喘患者中。另外,IL-4与IL-13表现出高度的结构相似性[13],通过相同的受体复合物发出信号并且两者共享几种信号转导途径。虽然过表达IL-4和IL-5的小鼠都表现出显著的杯状细胞分化异常,但这些细胞因子缺乏的小鼠在用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)进行外源性治疗后显示与对照相似的杯状细胞分化[11,14]。

2.3 Notch通路 Notch家族由4种(Notch1～4)跨膜受体蛋白组成,与配体结合后,Notch细胞内结构域通过两次蛋白水解切割释放事件和转移到细胞核以打开/关闭关键转录谱[15]。其中关键的转录效应子为重组信号结合蛋白-κJ。Notch信号通路可抑制气道上皮中的多纤毛素蛋白和Forkhead Box J1的表达,进而抑制纤毛细胞的分化[16]。

尽管Notch 与肺上皮细胞命运密切相关,但不同的Notch蛋白异构体引起的转录反应效应并不一样[17]。例如,Notch1和Notch2可激活淋巴增强子结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF-1),而Notch3确不能激活LEF-1[18]。最近,Notch2已经被鉴定为小鼠肺中炎性细胞因子驱动的杯状细胞化生的关键,且在体外分化的人支气管上皮细胞中也观察到这种效应。与此发现相反,Notch1或Notch3的过表达已被证明可以驱动在没有炎性细胞因子如IL-13的系统中的杯状细胞化生[14,17]。

2.4 STAT6信号通路 STAT6是由IL-13和IL-4选择性激活的关键转录因子,其影响多个靶基因的表达,包括激活后参与杯状细胞分化的部分重要基因[19],因此STAT6是细胞因子信号转导的中枢介质。STAT6 缺陷小鼠在IL-13暴露后不表现出杯状细胞的分化,但在STAT6重建后可恢复。STAT6也显示在哮喘气道上皮细胞的转录起始位点表现出异常的组蛋白乙酰化模式。STAT6 可上调GATA 结合蛋白3表达[20],其与Th2细胞因子和气道重塑的产生密切相关。有趣的是,尽管STAT6 缺陷型小鼠对IL-13刺激不敏感,但它们仍然能够在Notch信号通路激活后表现出杯状细胞分化的异常[4],表明尽管IL-13 介导的杯状细胞分化除依赖于STAT6外,还涉及IL-13/STAT6的独立途径[15]。

2.5 Wnt/β-连环蛋白信号通路 Wnt蛋白及其配体对成人肺部的肺形态发生和组织维持至关重要[14]。Wnt信号转导通路主要有经典(稳定和β-连环蛋白向细胞核易位)或非经典(β-连环蛋白非依赖)的两条信号通路。在经典途径中,Wnt配体用于稳定转录共激活因子β-连环蛋白在细胞溶质和核内的稳定表达,进而结合并激活许多下游转录因子[8],包括众所周知的LEF-1 和TCF-1/3/4。这受到Wnt配体与卷曲蛋白受体结合的调节[21]。

β-连环蛋白信号转导是响应Wnt配体和其他细胞外配体介导气道上皮细胞中分化和增殖的关键。在化学诱导哮喘的甲苯二异氰酸酯模型中,使用端锚聚合酶抑制剂(稳定β-连环蛋白破坏复合物)或使用β-连环蛋白/CBP抑制剂ICG-001进行治疗[12],两种情况下均显著降低杯状细胞的分化,表明β-连环蛋白在杯状细胞分化中的作用可能是刺激特异性的[22]。

2.6 其他相关的信号通路 除了上面列出的信号转导途径和细胞因子之外,还有许多新兴的候选蛋白和miRNA 也影响气道上皮细胞内的杯状细胞分化。如驱动蛋白家族成员3A 是已知的哮喘易感基因,它可通过气道上皮细胞中的Th2介导的途径调节气道过敏原反应。Runt相关转录因子2也与杯状细胞分化密切相关[23]。使用Runx相关转录因子2的sh RNA 干预后的小鼠也显著减少了气道黏液的产生和改善肺功能。另外miRNA 在影响上皮细胞分化上的能力也得到越来越多的认可。miR125b在哮喘儿童的痰液中显著降低,尤其是那些患有嗜酸粒细胞性哮喘的儿童。已显示miR-125a和miR-125b可直接靶向TNF-α诱导的蛋白3,进而影响杯状细胞的分化[24]。

3 相关药物及治疗策略

基于上述分析,我们可以发现有多重信号通路可影响杯状细胞的分化,进而使气道黏液分泌产生异常,引起哮喘等慢性气道炎症反应的加重[7]。针对相关靶点的药物及可能干预环节,我们总结了以下几点。但除了这些之外,我们还需要选择合适的细胞模型或者动物模型,以方便我们进行后续的药物筛选,靶点确认,药效评价等[10,15]。

3.1 药物治疗 多年来,杯状细胞异常分化的症状(即黏液分泌过多)而不是调控杯状细胞分化本身构成了主要的药理学靶点。这导致了针对黏液溶解/黏液调节活性的化合物数量的大量增加。氨溴索、N-乙酰半胱氨酸和碳半胱氨酸是常用的祛痰药[7],用于治疗具有失调的黏液分泌过多表型的疾病。尽管临床及动物实验都已经显示这些药物可以改善黏膜纤毛清除率并具有一定的抗哮喘效果[25],但它们并不针对黏液失调的原因,并且通常仅提供晚期改善和症状控制[12]。目前已经有一些针对杯状细胞分化中涉及的关键靶点的相关药物,并且已经产生了许多治疗药物。

皮质类固醇是治疗哮喘最常用的处方药,目前是缓解过敏性哮喘患者气道炎症的最有效方法。对于哮喘和COPD 更严重的患者,它们通常是无效的[26]。临床试验已经表明,布地奈德已被证明可显著降低哮喘患者杯状细胞异常分化。此外,皮质酮类药物如地塞米松已被证明可降低哮喘动物模型中的MUC5AC 产生和杯状细胞的异常分化。然而,单独的研究表明,皮质类固醇戒断后,可反弹性的引起杯状细胞的异常分化,甚至高过前期的过敏原诱导水平。有研究表明布地奈德治疗后[27],人支气管刷和支气管内活组织检查中,许多与杯状细胞分化相关的基因,如ErbB4和PI3K/AKT 信号通路,均受布地奈德影响而上调。因此,虽然皮质类固醇显然可以有效减少气道炎症,但是长期诱导参与杯状细胞分化的基因可能会增加炎症外持续性杯状细胞分化的可能性[28]。

抗胆碱能药,特别是噻托溴铵,在抗击COPD 方面显示出较好的效果,目前抗胆碱能药已被批准作为难以治疗的哮喘的附加治疗[29]。尽管乙酰胆碱作为调节支气管收缩和黏膜下腺黏液分泌的神经递质的作用最为人所知,但最近的研究结果也支持气道上皮细胞分泌的非神经元乙酰胆碱的作用[8]。通过噻托溴铵处理可以预防和逆转由IL-13在人气道上皮细胞中有炎症诱导的杯状细胞异常活化[12]。

山萘酚是一种常见的黄酮类化合物,可作为抗氧化剂,已知可阻断内质网应激反应。山萘酚减少卵清白蛋白致敏/攻击小鼠中的嗜酸粒细胞浸润和炎症以及下游黏液细胞分化。在除了抑制脂多糖诱导的嗜酸粒细胞趋化蛋白11表达外,山奈酚还能剂量依赖性地降低TNF-α刺激的细胞间黏附分子1在上皮细胞中的表达和整合素β2 在嗜酸粒细胞中的表达,从而减弱嗜酸粒细胞-气道相互作用。山萘酚被认为通过缓和JAK/STAT6信号通路,最终抑制核因子κB的活化[30]。

包括克拉霉素和雷帕霉素在内的大环内酯类抗生素亦可减轻慢性气道疾病的症状,除了减少气道高反应性、细胞因子分泌和气道炎症之外[31]。在过敏原暴露后,通过大环内酯类抗生素治疗后始终观察到杯状细胞数量的减少。克拉霉素可显著抑制IL-13 诱导的杯状细胞分化。同样,雷帕霉素已被证明可抑制急性哮喘模型小鼠气道内的黏液细胞的数量[7]。

另一类药物是EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼。迄今为止,吉非替尼已被确定为杯状细胞增生的潜在抑制剂。用吉非替尼预处理小鼠7 d,可减轻卵清白蛋白诱导的过敏性气道症状和病理,包括杯状细胞的异常分化,这种缓解可能是时间依赖性的。因此,吉非替尼可能更适合作为预防药物来治疗与过敏性哮喘相关的过量杯状细胞分化[32]。

3.2 单克隆抗体治疗 大量的研究表明,单克隆抗体因其靶向性好、特异性高、疗效佳而受到人们的广泛关注。在多种疾病中,如哮喘和COPD 等的治疗中都具有较大的优势。其相对小分子药物而言,优势主要体现在以下几点：(1)单克隆抗体具有较好的靶点特异性；(2)它们在分解后不形成有毒代谢物；(3)它们通常具有更长的半衰期。其中最公认的治疗靶点是结合并中和IgE,单克隆抗体的嵌合单克隆抗体[33]。奥马珠单抗是唯一批准用于治疗早发性严重IgE依赖性哮喘的单克隆抗体,并通过靶向IgE 的高亲和力结构域,阻止其与肥大细胞的相互作用起作用。奥马珠单还显著降低哮喘患者体内IL-13和外周嗜酸粒细胞,这对气道重塑的影响很大,尤其是杯状细胞的分化。其他一些靶点还包括IL-13、IL-5Rα和IL-4Rα等[34]。

3.3 利用miRNA 技术的疗法 通过外源性miRNA 的补充,进而靶向参与持久性杯状细胞异常分化的一些特定蛋白,从而达到哮喘的治疗亦是一个可行的治疗策略[13]。我们把这些外源性的 miRNA 称为antagomirs。Antagomirs是与特定miRNA 完全互补的小寡核苷酸,已被证明可导致miRNA 的有效降解。实际上,在小鼠中许多基于antagomir的研究已经取得了较好的结果。例如,哮喘小鼠模型中miR-126和let-7 miRNA 家族的抑制减少了炎症细胞的总数,促炎性细胞因子的产生以及MUC5AC 的水平。同样抑制miR-106a或miR221可减轻哮喘小鼠模型中的炎症。因此,使用miRNA antagomirs和模拟物不仅可以改善持续性杯状细胞异常分化,还可以改善慢性气道疾病的其他病理生理学特征[14]。

目前对于antagomirs的递送,可以采用气溶胶递送,这可以增加气道上皮对药物的有效利用,并减少全身递送带来的潜在不良反应。但在慢性气道疾病患者中,如哮喘患者中,其气道黏液层较厚,这对气溶胶的递送有一定的影响。我们可以将antagomir分子与黏液溶解气溶胶性能增强剂(如D-甘露醇)结合,以增加气道上皮相互作用并允许其转运到细胞中,此外纳米颗粒的吸入技术亦可解决上述问题[33]。

4 结论

气道中黏液的积累是慢性气道疾病,尤其是小儿哮喘的关键特征。解决慢性气道疾病期间持续性的杯状细胞分化是消除腔内黏液积聚,进而引起下游系列病变,对于哮喘的治疗至关重要。目前几种关键信号通路的失调可导致哮喘疾病状态下的持续性杯状细胞分化异常,如EGFR 信号通路,IL-13、IL-4、IL-5和IL-9,Notch,WNT/β-连环蛋白,STAT6等。而针对上述靶点的治疗策略,如相关药物、相关的单克隆抗体、miRNA 等都可以有效缓解杯状细胞的异常分化,进而改善哮喘的相关症状。后续仍需重点关注相关动物模型,人源化的细胞模型等来进行相关药物的开发,从而为满足小儿哮喘的治疗提供保障。

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